乙醛脫氫酶2(ALDH2)促進慢性缺血組織血管新生作用的基礎與臨床研究.pdf

1、缺血性心臟病是人類健康主要殺手之一。據(jù)統(tǒng)計，美國20歲以上成年缺血性心臟病總患病率為7.0％，是死亡最常見原因之-[1，2]。在我國，隨著經(jīng)濟增長和生活水平的提高，缺血性心臟病的患病率和死亡率逐年上升。盡管藥物治療、介入治療、外科手術治療取得了很大進步，但約20％患者不能進行這類治療或者治療效果不佳[3]。臨床研究已證實良好的側枝循環(huán)可以保護缺血心肌，提高缺血性心臟病病人的生存率[4，5]。如何促進側枝循環(huán)的建立已成為目前防治缺血性心臟

2、病的一大熱點。嚴重缺血性心臟病患者中，血管內皮生長因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)、缺氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)已被證實能促進側枝循環(huán)的形成[6，7]。
　　乙醛脫氫酶2(Aldehyde dehydrogenase，ALDH2)位于線粒體，是一種主要的醛類氧化酶。ALDH2基因存在一些常見突變，東亞人群中Glu504

3、Lys突變具有很高的出現(xiàn)頻率，在中國漢族人群中攜帶者約為34％，日本人群中約占46％。攜帶該突變將引起個體酶活性降低，雜合子僅為野生型個體ALDH2活性的十六分之一，突變純合子體內幾乎沒有該酶活性[8,9]。早期主要認為ALDH2主要是酒精代謝中的關鍵酶，催化具有毒性的乙醛代謝為無毒性的乙酸的反應，乙酸在體內可以繼續(xù)參與供能反應。2008年Science報道，ALDH2通過激活蛋白激酶Cε(Protein kinase Cε， PKCε

4、)途徑，在缺血再灌注損傷模型中發(fā)揮顯著保護作用[10]。近年來，ALDH2逐漸被被證實為一種重要的內源性心臟保護因子，在心梗后心衰、心臟缺血再灌注損傷、酒精性心肌病等方面發(fā)揮重要保護作用[11]。
　　本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn):ALDH2可以對心梗后慢性缺血心肌發(fā)揮保護作用，這是通過減少脂質過氧化產(chǎn)物毒性醛類物質如4-羥基壬烯醛(4-Hydroxynonenal，4-HNE)的產(chǎn)生，從而抑制JNK/p53途徑來實現(xiàn)。2007年Natu

5、re有文章表明[12]，主動脈縮窄引起的心臟壓力負荷模型中，心肌細胞肥大而與之匹配的血管新生不足，導致心肌細胞相對缺血，p53通過下調HIF-1a抑制血管新生，加重心肌缺血使心功能進一步惡化;反之，抑制p53能通過促進心肌細胞周圍血管新生，有效改善心肌供血，從而提高小鼠心臟射血分數(shù)。因此，ALDH2是否參與調控血管新生？同時，ALDH2參與線粒體活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生[13]，而ROS亦可以

6、調控HIF-1/VEGF途徑[14]。因此本研究將從血管新生的角度研究，ALDH2作為一種內源性缺血保護因子，是否通過HIF-1/VEGF途徑在慢性缺血過程中調控血管新生，從而改善組織血供代償，促進缺血組織功能。
　　冠狀動脈慢性閉塞病變(Coronary total occlusion，CTO)由于病變的嚴重程度和復雜程度，具有難治性，被認為是冠脈介入治療領域“最后的前沿”，側枝循環(huán)的形成對CTO患者維持基礎心功能至關重要[15

7、]?？紤]到ALDH2在亞洲人中具有接近半數(shù)的突變攜帶率，因此ALDH2基因型對CTO患者的側枝循環(huán)形成能力的作用，對于臨床工作中CTO病變高危人群的預防、治療策略的選擇和預后判斷都將具有重要意義。本研究將通過收集CTO患者，來研究ALDH2基因分型和與其冠脈側枝循環(huán)Rentrop分級的關系及其臨床影響因素，從而說明ALDH2在臨床缺血性心肌病中的作用。
　　綜上所述，本研究旨在研究ALDH2對慢性缺血組織血管新生的作用，并進一步闡

8、明其分子作用機制，并通過對ALDH2基因型與CTO患者冠狀動脈側枝循環(huán)關系的臨床研究來驗證ALDH2對血管新生的作用和在人群中特別是東亞人群中的影響。本研究有望從血管新生角度探討出ALDH2對慢性缺血心肌發(fā)揮保護的作用機制，闡明ALDH2基因型差異對CTO患者臨床表型及預后的影響，并有望為此類患者的個體化治療原則提供參考依據(jù)，如對ALDH2缺失型患者采取更積極的血運重建。全文共分為以下三部分:
　　第一部分 ALDH2調控慢性缺血

9、組織的血管新生能力
　　背景: 血管新生對于缺血性心臟病的發(fā)展和預后至關重要，乙醛脫氫酶2(Aldehyde dehydrogenase，ALDH2)的心肌保護作用近年來備受關注，本研究旨在探索ALDH2對慢性缺血組織血管新生的調節(jié)作用。
　　方法: 動物實驗，采用8周雄性ALDH2基因敲除小鼠(ALDH2-KO)和野生型C57BL/6小鼠(WT)制作下肢缺血模型，于術后1天、7天和21天用激光多普勒儀測量下肢血流灌注水平。

10、細胞水平實驗，培養(yǎng)大鼠心肌微血管內皮細胞(Microvascular endothelial cells，MECs)，通過轉染ALDH2-siRNA建立ALDH2低表達細胞;分別設立正常氧分壓組和缺氧發(fā)生劑模擬缺氧6小時組，通過Metrigel膠培養(yǎng)觀察各組微血管內皮細胞的成管能力。
　　結果: 動物實驗，激光多普勒檢測以小鼠健測為對照統(tǒng)計患側/健側血流灌注比，發(fā)現(xiàn)ALDH2-KO小鼠下肢血流恢復水平比野生型小鼠更差，21天時具有

11、顯著統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。ALDH2-KO小鼠腓腸肌萎縮更加顯著，并且免疫組化顯示ALDH2-KO小鼠缺血區(qū)域的小動脈新生少。細胞水平實驗，觀察到對大鼠心肌MECs給予ALDH2-siRNA干擾后，在正常氧分壓組及缺氧6小時組，與對照組相比ALDH2低表達細胞Metrigel膠成管能力顯著減弱。
　　結論: 上述結果說明，ALDH2缺陷能夠抑制慢性缺血組織的血管新生，阻礙自身血運重建和功能重建。從血管新生的角度解釋了ALDH

12、2對慢性缺血心肌的保護作用，為臨床缺血性疾病治療提供新的藥物作用靶點。
　　第二部分 ALDH2通過上調HIF-1α/VEGF途徑促進血管新生
　　背景: 近年來，ALDH2逐漸被被證實為一種重要的內源性心臟保護因子，在心梗后心衰、心臟缺血再灌注損傷、酒精性心肌病等方面發(fā)揮非常關鍵的保護作用。第一部分研究發(fā)現(xiàn)ALDH2缺陷能夠顯著減弱慢性缺血組織的血管新生，本研究旨在闡明其內在分子機制。
　　方法: 動物實驗，分組及造

13、模同第一部分，分別取術后1天、7天和21天小鼠雙側股四頭肌提蛋白。細胞實驗，培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞細胞系(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)進行信號通路的研究，通過轉染病毒建立ALDH2低表達及高表達細胞模型，設立正常氧分壓組和缺氧6小時組。分別對上述小鼠股四頭肌組織和細胞，采用Western Blot方法檢測ALDH2、缺氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible fac

14、tor-1α，HIF-1α)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等蛋白表達水平。
　　結果: 動物實驗，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，ALDH2-KO小鼠缺血側股四頭肌組織在缺血后1周時與野生型小鼠相比，HIF-1α和VEGF蛋白水平顯著降低(p＜0.05)。培養(yǎng)HUVECs細胞進行Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，上調ALDH2的表達， HIF-1α、VEGF蛋

15、白水平增加;而轉染質粒抑制ALDH2表達，則HIF-1α、VEGF蛋白水平顯著降低。
　　結論: 上述結果說明，ALDH2能夠通過調節(jié)HIF-1α/VEGF通路，對慢性缺血組織的血管新生發(fā)揮調節(jié)作用，從而通過改善缺血組織血供促進功能重建。本研究解釋了ALDH2調控血管新生的內在分子機制。
　　第三部分 ALDH2基因型對CTO患者冠狀動脈側枝循環(huán)分級的臨床研究
　　背景: 冠狀動脈慢性閉塞病變(Coronary tot

16、al occlusion，CTO)被認為是冠脈介入治療領域“最后的前沿”，冠狀動脈側枝循環(huán)(Coronary collateral vessels，CCVs)的形成對CTO患者維持基礎心功能至關重要。ALDH2 Glu504Lys突變在亞洲人群中具有接近半數(shù)的突變攜帶率。本研究旨在從臨床的角度，闡明ALDH2基因型對慢性缺血心肌血管新生作用。
　　方法: 通過中山醫(yī)院倫理審查和獲得患者同意后，從在上海中山醫(yī)院進行冠狀動脈造影的患者

17、中，選擇收集冠狀動脈慢性閉塞病變(Chronic total occlusion，CTO)患者;入選條件:左主干、左前降支、回旋支和/或右冠狀動脈至少一支完全閉塞，病程大于等于3個月;排除條件:急性心肌梗塞(acute myocardialinfarction，AMI)，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous coronary intervention，PCI)術后，冠狀動脈旁路移植術(Coronary artery bypas

18、s grafting，CABG)術后，或合并先心、瓣膜病和外周血管疾病等。根據(jù)患者冠脈造影圖像進行側枝循環(huán)Rentrop分級（0級和1級合并為側枝循環(huán)不良組，2級和3級合并為側枝循環(huán)良好組），對ALDH2基因測序分型，收集患者臨床資料，采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結果: 根據(jù)入選和排除條件共有153名CTO患者納入研究，發(fā)現(xiàn)在ALDH2野生型中(n=83)側枝循不良者占38.5％;突變雜合型攜帶患者中(n=63)側

19、枝不良者占44.4％;而在突變純合型攜帶患者中(n=7)側枝不良者(n=5)占71.4％，與野生型和雜合型相比側枝循環(huán)更差(p＜0.05)。
　　結論: 上述結果從臨床水平亦證明ALDH2活性對血管新生十分重要。并且臨床中在慢性缺血性心臟病病患者中，ALDH2缺陷的個體顯示出了更差的心臟側枝循環(huán)形成能力，Glu504Lys突變純合型個體（占亞洲人口的6～10％）。本研究為臨床對攜帶ALDH2突變的CTO患者采取更加積極的血運重建治