PELA為載體的GST緩釋疫苗微球的制備工藝研究.pdf

1、谷胱甘肽S—轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS—transferase，GST)是目前國際上公認的血吸蟲疫苗的主要侯選蛋白之一，通過基因工程技術對GST蛋白進行克隆和表達，可解決以往疫苗篩選所涉及的蟲源困難問題，并可保證疫苗的安全性。由于GST疫苗在體內(nèi)易快速降解和消除，且單獨使用免疫效果欠佳等缺陷，大大影響了疫苗的臨床應用。生物可降解聚合物微球是一種具有佐劑效應的疫苗緩控釋系統(tǒng)，它可以提供大量抗原并防止其在生理條件下的快速降解，通過微球

2、對所包埋抗原的持續(xù)或脈沖釋放行為，有效模擬傳統(tǒng)疫苗的多次免疫過程，可以在相當長時間內(nèi)持續(xù)提供抗原，從而減少接種次數(shù)和免疫原的使用總量，增強病人的適應性，降低用藥成本。本論文圍繞生物可降解微球載體的制備工藝、體外質(zhì)量評價以及緩釋疫苗微球的制備和評價開展了一系列的研究工作，論文共分為以下四個部分： 第一部分綜述 對目前生物技術藥物，特別是蛋白多肽類和疫苗類藥物的緩釋微球的研究進展進行了綜述，主要包括制備微球常用的載體材料、常

3、用的制備方法、緩釋微球的體外釋放特征、緩釋微球的穩(wěn)定性研究等幾個方面的內(nèi)容；概述了目前國內(nèi)外緩釋疫苗微球給藥系統(tǒng)的發(fā)展趨勢，為論文后續(xù)實驗工作的開展奠定基礎。 第二部分PELA微球載體的制備.以乙酸乙酯為有機溶劑，牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)為模型藥物，采用復乳溶媒揮發(fā)法制備了聚乳酸—聚乙二醇共聚物(Poly—D，L—lactide—co—poly(ethyleneglycol)，PELA)微球。

4、以微球的包封率和載藥量為指標，考察了有機溶劑種類、載體材料、穩(wěn)定劑類型、聚乙烯醇(Polyvinylalcohol，PVA)濃度以及內(nèi)相水油比例等因素對微球制備的影響，同時考察了各處方所得微球的形態(tài)。在單因素試驗的基礎上，選取對微球制備影響較大的3個因素：藥載比、PELA濃度、PVA體積進行正交試驗，確定優(yōu)化處方。最后確定的處方工藝是：乙酸乙酯為有機溶劑；PELA為載體材料，其濃度為50mg·mL-1；2％PVA為外水相穩(wěn)定劑，其體積為

5、20mL；內(nèi)相水油比為1：10：藥載比為1：5。 第三部分PELA微球載體的體外質(zhì)量評價.主要圍繞所制PELA微球的形態(tài)、粒徑、載藥量、包封率、體外釋藥性質(zhì)等展開一系列的研究工作。經(jīng)實驗摸索，建立了測定PELA微球載藥量和包封率的紫外—可見分光光度法，具體方法：用0.3mol·L-1NaOH—SDS(2％)溶液溶解微球，游離藥物經(jīng)HCL中和后用紫外—可見分光光度法測定PELA微球載藥量和包封率。掃描電子顯微鏡觀察微球的形態(tài)；激光

6、粒度儀測定微球的粒徑分布；初步研究了微球的體外釋藥特征，并對影響藥物突釋的因素進行了分析。結(jié)果表明：本實驗建立的紫外—可見分光光度法測定PELA微球載藥量和包封率，方法快速簡便，重現(xiàn)性好，測得BSA—PELA微球的平均載藥量和包封率分別是12.44％和86.31％。掃描電子顯微鏡觀察微球呈類球形，顆粒均小于10μm，激光粒度儀測得微球的平均粒徑為6.585μm，結(jié)果與電鏡照片相吻合。體外釋藥結(jié)果顯示，微球的釋放可以分為兩個階段，0—3天

7、釋放曲線可用Higuchi方程擬合(Q=0.2681t1/2—0.0064，r=0.9983)，4-28天的釋放曲線可用零級動力學方程擬合(Q=0.0051t+0.5023，r=0.9949)，28天累積釋藥為64.83％，具有明顯的緩釋效果。 第四部分GST微球的制備及其質(zhì)量評價主要圍繞緩釋疫苗微球的制備、形態(tài)和粒徑、載藥量和包封率、體外釋藥特征、微球包裹前后疫苗蛋白的結(jié)構變化、微球中溶劑殘留等展開了一系列的研究工作。建立了緩

8、釋疫苗微球載藥量和包封率的測定方法，即先將疫苗微球消解后，采用BCA法測定疫苗微球的載藥量和包封率；掃描電子顯微鏡觀察疫苗微球的形態(tài)；激光粒度儀測定疫苗微球的粒徑分布；初步研究了疫苗微球的體外釋藥特征；十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)法觀察包裹前后蛋白質(zhì)結(jié)構的變化；毛細管氣相色譜法(GC)分析微球中乙酸乙酯殘留量。結(jié)果表明：疫苗微球的平均載藥量和包封率分別是5.12％和75.25％；電子顯微鏡觀察疫苗微球呈球形；激

9、光粒度儀測得疫苗微球的平均粒徑為5.387μm，結(jié)果與電鏡照片相吻合；SDS—PAGE電泳結(jié)果顯示，包裹前后GST的分子量沒有發(fā)生變化，保持其分子結(jié)構的完整；體外釋藥結(jié)果顯示，疫苗微球的釋放可以分為兩個階段，0—3天釋放曲線可用Higuchi方程擬合(Q=0.2537t1/2—0.0005，r=0.9977)，4-28天的釋放曲線可用零級動力學方程擬合(Q=0.0071t+0.4875，r=0.9922)，28天累積釋藥為69.10％，