PP4c干擾后對大鼠垂體泌乳素瘤細胞增殖和多巴胺受體表達的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、垂體泌乳素瘤是最常見的具有內分泌功能的垂體瘤,約占垂體瘤總數的4596左右。近年的流行病學調查發(fā)現,泌乳素瘤的發(fā)生率在女性高達1/1050,在男性也高達1/2800。PP4(蛋白磷酸酶4)是一種絲/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶,其功能主要是對磷酸化的某些蛋白質進行去磷酸化,使之功能發(fā)生變化。本課題組主要成員已經成功建立了正常人下丘腦一垂體一腎上腺軸的基因表達譜,并已采用cDNA微陣列雜交和ESTs大規(guī)模測序的方法建立了人垂體瘤和其他內分泌腫瘤組

2、織的基因表達譜,發(fā)現相對正常垂體組織而言,泌乳素瘤組織中PP4的表達明顯升高,并經Realtime—PCR初步證實,提示PP4可能在垂體泌乳素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用,但這方面的確切機制在國內外尚未有相關研究報道。本試驗旨在通過小RNA干擾技術探討PP4對泌乳素瘤細胞增殖活性和多巴胺受體表達的影響。 第一部分 PP4csiRNA對MMQ細胞PP4e基因表達的干擾作用 目的:應用小RNA干擾技術研究設計的三條PP

3、4csiRNA序列對MMQ細胞PP4c基因表達的干擾作用。 方法:掃描PP4cmRMA的全序列(序列號為NM_134359),從AUG啟動子開始記錄含從雙核苷酸的19個核苷酸肽作為潛在作用靶點,含量控制在30%-50%,并用BLAST分析排除與其它基因有高度同源性的序列。本試驗用Ambion公司設計軟件設計并合成3條含21個堿基的siRNA(siRNAl,siRNA2,siRNA3)及隨機陰性對照(siRNAcon)。在SiPO

4、RTNeoFX介導下轉染MMQ細胞,分別于轉染后24h,48h,72h收集細胞,用半定量RT一PCR方法檢測轉染后PP4cmRNA的變化,WesternBlot檢測PP4c蛋白表達的變化。 結果:體外合成的三條siRNA通過SiPORTNeoFX轉染后,siRNAI抑制PP4c表達的作用最強,MMQ細胞表達的PP4c在轉染后24h開始抑制,48h抑制作用最明顯,72h抑制作用開始減弱。單用siPORTNeoFX轉染與siRNAc

5、on轉染均不會明顯抑制PP4c的表達。 結論:PP4csiRNAl通過降低PP4cmRNA水平特異性抑制PP4c蛋白表達的效率最高。 第二部分 小RNA干擾抑制PP4c表達對刪Q細胞增殖和凋亡的影響目的:通過小RNA干擾技術研究PP4c表達抑制后對MMQ細胞增殖和凋亡的影響。 方法:選用抑制作用最強的PP4csiRNAl序列進行功能研究。用MTT法觀察抑制PP4c表達對MMQ細胞增殖活性的影響。通過P工單

6、染法和AnnexinV/PI雙染法用流式細胞儀檢測抑制PP4c表達對MMQ細胞凋亡的影響,用比色法測定抑制PP4c的表達對caspase3活性的影響。 結果:PP4c小RNA干擾24小時后對MMQ細胞增殖有顯著抑制作用,且隨著作用時間的延長,對刪Q細胞增殖活性的抑制作用逐漸增強,48小時抑制作用最強[空白對照組00值為0.83±0.07,PP4c干擾組為0.49+0.08,p

7、P4c表達對細胞周期沒有明顯影響,但可誘導出現sub~G1峰,MMQ細胞的凋亡比例為(10.08±2.15)%,明顯高于空白對照組[(0.00±0.14)%,p

8、37±0.007,P

9、T—PCR和Western—Blotting法觀察抑制PP4c表達對多巴胺受體(D2R)mRNA和蛋白水平的影響。PP4csiRNA后分別抽提MMQ細胞胞漿蛋白和胞核蛋白用Western—Blotting法觀察NF一KBp65的分布和IKB的表達,用EMSA的方法觀察抑制PP4c表達對NF一KB轉錄活性的影響。用時間分辨熒光免疫分析法檢測細胞分泌PRL的變化。 結果:PP4c小RNA干擾48小時后促進MMQ細胞多巴胺受體(D2R

10、)mRNA和蛋白水平的表達。PP4csiRNA后NF-KBp65在細胞核中的表達增加,IKB在細胞漿中表達減少。EMSA法觀察到PP4csi組細胞DNA結合的標記電泳帶明顯增加,與p65蛋白抗體同時孵育發(fā)現有supershift條帶。PP4csiRNA+低劑量BC組細胞PRL分泌顯著減少[空白對照組為(39.65~13)ng/ml,PP4csiRNA+BC組為(17.17~8.7)ng/na,p

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