骨松靈合劑對去卵巢大鼠成骨細胞增殖及Ⅰ型膠原、雌激素受體表達的影響.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松癥(osteoporosisOP)是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨骼脆性增加和易發(fā)生骨折的全身代謝性疾病。骨質(zhì)疏松癥已成為影響健康的重要問題，在絕經(jīng)后婦女中發(fā)生率達到20％～40％。中藥治療骨質(zhì)疏松癥，以其含有多種成分可能通過多個環(huán)節(jié)而起作用?；蛘咄ㄟ^促激素或類激素作用調(diào)整紊亂的內(nèi)分泌系統(tǒng)，或者直接作用于破骨細胞和成骨細胞。成骨細胞在骨再建中起重要作用，用離體成骨細胞培養(yǎng)可觀察到藥物對成骨細胞的直接作用。這一

2、方法簡便易行，結(jié)果可靠，可作為篩選抗骨質(zhì)疏松活性植物成分的方法。本研究的主要目的是觀察骨松靈合劑對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞增殖與分化的影響，從mRNA及蛋白水平研究骨松靈合劑對成骨細胞Ⅰ型膠原、雌激素受體(ER)表達的影響，從雌激素調(diào)控途徑探討骨松靈合劑防治骨質(zhì)疏松癥的機理，從細胞水平探討骨松靈合劑對骨代謝的可能作用機制。 方法：分離培養(yǎng)出生24h內(nèi)SD大鼠顱骨，將其剪成1-3mm3的小塊，置15％FCS-DMEM培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)

3、，用含15％FCS-DMEM調(diào)細胞濃度為1×105個/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，0.2ml每孔，然后加入0，30，60，120，240，480mg/ml的骨松靈合劑，每種濃度16孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，加入MTT溶液，紫外可見光分光光度計測不同時間每孔的光密度值，分析成骨細胞增殖情況，然后取第三代OB接種于24孔細胞培養(yǎng)板，分為四組，骨松靈合劑組、雌二醇組、空白血清組、DMEM對照組，每組6孔，分別培養(yǎng)24、48、72小時

4、后，提取成骨細胞總RNA，取1μlRNA溶液經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定進行RNA的純度和完整性，紫外燈下觀察并照相取。取1μl經(jīng)稀釋后于260、280nm測定光密度，計算RNA含量及OD260/OD280比值以確定其純度。OD260/OD280比值大于1.8的RNA樣品進行RT-PCR，RT-PCR反應(yīng)后，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1％的瓊脂糖膠電泳，多功能暗箱式紫外光投射儀照相，進行光密度和面積掃描，分析積分光密度值，計算每一產(chǎn)物和其內(nèi)參積分光

5、密度比值。然后再對成骨細胞ER進行免疫細胞化學染色，應(yīng)用醫(yī)學圖像分析儀測定陽性細胞灰度值，觀察骨松靈合劑對體外培養(yǎng)的大鼠成骨細胞ERα、ERβ表達的影響。所有結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。 結(jié)果： 1.成骨細胞培養(yǎng)24小時后，30，60，120，240mg/ml的骨松靈合劑組與0mg/ml骨松靈合劑組光密度值相比有顯著性差異，說明均對成骨細胞均有促增殖作用(P＜0.05)，48h、72h后，120mg

6、/ml的骨松靈合劑組與對照組(0mg/ml骨松靈合劑組)相比，仍有顯著性差異(P＜0.05)，說明120mg/ml的骨松靈合劑仍有此作用，其他濃度骨松靈合劑組光密度值與對照組相比沒有顯著性差異，故對成骨細胞促增殖作用消失(P＞0.05)。 2.RT-PCR后電泳結(jié)果顯示：120mg/ml骨松靈合劑組培養(yǎng)成骨細胞24h、48h、72h后均可增加成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA表達，不同時間之間有顯著性差異(P＜0.05)，并有時間依賴性，

7、隨著時間的增加，成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA表達增加，雌激素治療組也有此作用(P＜0.05)。但與120mg/ml骨松靈合劑組之間無顯著性差異(P＞0.05)，120mg/ml骨松靈合劑組和雌激素治療組與空白血清組和DMEM對照組均有促進成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA表達的作用，空白血清組和DMEM對照組無此作用(P＞0.05)，120mg/ml骨松靈合劑培養(yǎng)成骨細胞24h、48h、72h后均可增加成骨細胞ERαmRNA，ERβmRNA表達(P＜

8、0.05)，ERαmRNA表達在培養(yǎng)24h后有所增加，48h、72h較24h無明顯變化(P＜0.05)；ERβmRNA表達增加有時間依賴性。雌激素治療組也有此作用(P＜0.05)，但與120mg/ml骨松靈合劑組相比無顯著性差異，而空白血清組和DMEM對照組無此作用(P＞0.05)。 3.成骨細胞免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，ERα和ERβ在成骨細胞中均有表達，但主要在成骨細胞核內(nèi)表達明顯，胞漿內(nèi)也有少量表達，陽性顆粒為棕黃色，與對

9、照組相比，經(jīng)120mg/ml骨松靈合劑處理后，成骨細胞內(nèi)ERα染色陽性顆粒明顯增加，各時間24h、48h、72h著色加深，各時間點未見差別，ERβ染色陽性顆粒表達增強，且具有時間依賴性。 結(jié)論 1.骨松靈合劑在一定的濃度范圍內(nèi)，從細胞水平可以促進去卵巢大鼠成骨細胞增殖，增加成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA表達。 2.骨松靈合劑可促進成骨細胞的分化，在整體水平表現(xiàn)為增加骨形成。 3.成骨細胞的活性與ER的表達水平之