PRRS病毒GP5的基因序列分析及其重組蛋白的應(yīng)用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是以母豬流產(chǎn)及仔豬呼吸系統(tǒng)障礙為主要病征的傳染病，病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。該病毒傳染性強(qiáng)，而且感染機(jī)體后導(dǎo)致免疫抑制及各種并發(fā)癥，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害和經(jīng)濟(jì)損失。病毒基因的變異也給防治增加了難度。糖基化囊膜蛋白5(GP5)是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有結(jié)合細(xì)胞受體及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功能；而且該蛋白能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生，是新型疫苗設(shè)計(jì)的主要靶蛋白，因此在病毒的生理功能及PRRS的防治上具有重

2、要作用。 本研究對(duì)閩南地區(qū)流行的PRRSV毒株FJ-1的GP5編碼基因ORF-5進(jìn)行分子克隆，并對(duì)其核酸序列進(jìn)行測(cè)定及分析，為該病的流行病學(xué)調(diào)查提供理論依據(jù)；同時(shí)，利用大腸桿菌在體外表達(dá)了GP5，并對(duì)重組蛋白的抗原特性進(jìn)行研究；針對(duì)有些PRRSV疫苗未能對(duì)豬機(jī)體提供完全保護(hù)的情況，本研究還建立了一個(gè)間接ELISA體系來對(duì)疫苗免疫后的豬血清中的抗GP5抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，來間接反應(yīng)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體的水平，為針對(duì)該病的新型疫苗以及評(píng)

3、價(jià)疫苗免疫效果的試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。 從福建省某種豬場(chǎng)采得患病豬肺病料，提取豬肺組織的總RNA并利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼GP5的ORF5基因。目的DNA片段連接到pUcm-T載體上進(jìn)行DNA序列測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)福建毒株FJ-1ORF5基因大小為603bp，編碼200個(gè)氨基酸殘基，與美洲型參考毒株VR-2332、Ch-a及歐洲型參考毒株LV的氨基酸同源性分別為87％、89％和53％，因此推定FJ-1屬于美洲型毒株。根據(jù)已分離

4、的PRRSV毒株ORF5基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，從中可發(fā)現(xiàn)福建毒株FJ-1與其他美洲型毒株的同源性較低。 設(shè)計(jì)引物從重組質(zhì)粒pUcm-T-ORF5中擴(kuò)增出缺失了N端30個(gè)氨基酸殘基的tGP5編碼序列tORF5，并在C末端帶上6聯(lián)組氨酸(6×His)標(biāo)簽編碼序列，目的基因亞克隆構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-tORF5，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE及Western-blot分析，證實(shí)為tGP5與谷胱甘肽

5、轉(zhuǎn)移酶(GlutathloneS-transferase，GST)的融合表達(dá)蛋白，分子量為41kDa，表達(dá)量占菌體總蛋白的15％，主要以包涵體形式存在。經(jīng)過Ni離子樹脂親和層析純化后的GST-tGP5蛋白純度可達(dá)95％以上，并能與PRRSV陽性豬血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)，而標(biāo)簽蛋白GST不與該血清反應(yīng)。將純化后的表達(dá)蛋白包被ELISA板后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陰/陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在抗原包被濃度為1640ng/孔，血清稀釋度為10倍稀釋的條件下P/N值最

6、大。用此試驗(yàn)條件對(duì)12份PRRSV陰性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)后推導(dǎo)出以S/P值0.6作為陽性血清判定的臨界點(diǎn)。S/P值大于0.6的血清判斷為陽性血清，反之小于0.6的為可疑或陰性。此檢測(cè)體系的結(jié)果與Dot-blot所測(cè)定的結(jié)果一致性達(dá)92.5％。以純化后的融合蛋白作為抗原免疫小鼠，制備出的抗GST-tGP5融合蛋白血清經(jīng)GST吸附扣除抗GST干擾抗體后，得到跟tGP5特異性反應(yīng)的多克隆抗血清，其滴度約為6400。但該抗血清是否能在體外甚