單倍體相合造血干細胞移植后T細胞免疫重建規(guī)律的初步研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是白血病、淋巴瘤和重型再生障礙性貧血等血液系統(tǒng)疾病的有效治療方法。然而,由于供受者之間嚴格的人類組織相容性抗原(human leukocyte antigen,HLA)的限制,不足30％患者可以接受HLA相合HSCT。然而,單倍體相合造血干細胞移植(Haplo-identical HSCT,Haplo-H

2、SCT)則適用于幾乎所有患者。
　　自1983年Powles等首次報告Haplo-HSCT以來,血液學家對這種新的移植方式進行了初步的臨床研究。但是,早期的臨床試驗是不成功的,多數患者死于移植排斥和重度移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。近幾年,人們對Haplo-HSCT的方案進行了改良和完善,使Haplo-HSCT兩年無病存活率接近HLA相合HSCT,也使我國Haplo-HSCT處于國

3、際領先水平。我們在國內較早開展了Haplo-HSCT,建立了比較成熟的預處理和GVHD預防方案,取得了較好的效果。
　　然而,Haplo-HSCT后免疫重建嚴重遲緩,持續(xù)的細胞免疫功能低下,導致感染和復發(fā),已成為移植后患者主要死亡原因。
　　由于T細胞既是細胞免疫的重要參與者,又是體液免疫的調節(jié)者,因此T細胞免疫重建最受關注。其重建主要有兩條途徑:
　　(1)外周途徑:移植物中的T細胞在外周免疫器官內快速擴增,這種方式

4、不依賴胸腺功能;
　　(2)胸腺依賴途徑:T淋巴祖細胞遷徙至胸腺,在胸腺內發(fā)育成熟,產生具有多樣性T細胞受體(T cell receptor,TCR)的初始T淋巴細胞(naive T lymphocyte,naive T,初始T細胞),形成穩(wěn)定持久的免疫重建。然而,為預防急性GVHD的發(fā)生,Haplo-HSCT常采用體外去除移植物中T細胞,或受者靜脈輸注抗人胸腺細胞免疫球蛋白(anti-thymocyte globuline,AT

5、G)以內源性去除T淋巴細胞,T細胞免疫重建更多依賴第二條途徑。
　　近幾年,隨著分子及細胞免疫學的發(fā)展,產生了一些新的免疫狀態(tài)的監(jiān)測方法,如通過T細胞受體切除環(huán)(T-cell receptor excision circle,TREC)數量和T細胞受體β鏈可變區(qū)(T-cell receptor β chain variable region,TCRVβ)多樣性來評估胸腺輸出功能,通過CD4+T細胞產生的ATP數量(ImmuKnow

6、技術)評價T細胞總體功能等,這些方法已經實體器官移植中得以應用;同時,也有一些涉及HSCT的報告相繼發(fā)表。
　　盡管人們已經認識到Haplo-HSCT免疫重建的重要性,但是,有關T細胞免疫重建的規(guī)律及其影響因素等,系統(tǒng)的報道卻不多。本研究對在我院接受Haplo-HSCT的31例患者,選用我們通用的預處理方案和aGVHD預防措施,初步分析其移植后的造血植入情況,移植后6個月內aGVHD、感染及復發(fā)情況;并系統(tǒng)觀察Haplo-HSCT

7、前及移植后6個月內T細胞亞群細胞數量的變化及sjTREC數量、TCR-Vβ多樣性、CD4+T細胞產生ATP數量,結合臨床常規(guī)檢查及病例特點,初步研究Haplo-HSCT后早期T細胞免疫重建規(guī)律及指標臨床相關性。本研究可能為指導臨床治療的諸多細節(jié),如免疫抑制劑的增減,移植后供者淋巴細胞輸注(donor lymphocyte infusion,DLI)等提供一定的參考。
　　研究方法：
　　1、以臨床常規(guī)使用的微量序列特異引物聚

8、合酶鏈反應(sequence-specific primers PCR,PCR-SSP)技術進行HLA分型。
　　2、對于31例接受Haplo-HSCT的患者,采用我院常規(guī)的預處理和GVHD預防方案,選用G-CSF動員后的外周血和骨髓作為干細胞來源。
　　3、細胞標記分析:采用流式細胞術分析的方法,進行相關表面抗原及胞漿抗原陽性細胞檢測。選用適宜的FITC,PE,APC或PerCP標記的單克隆抗體標記細胞,監(jiān)測移植物中CD3

9、4+細胞比例,移植前后患者外周血中T細胞亞群比例,并根據血細胞分析中白細胞總數計算出T細胞各亞群細胞數絕對值。造血干/祖細胞標記為CD34+,初始T細胞的判定指標為CD4+/或CD8+/CD45RA+/CD62L+細胞;記憶T淋巴細胞(memory T lymphocyte,memory T,記憶T細胞)標記為CD4+/CD45RO+或CD8+/CD45RO+。調節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)標記為CD4+/

10、CD25+/FOXP3+。
　　4、sjTREC測定:取病人外周血,密度梯度離心分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),提取基因組DNA。采用文獻報道的引物,實時定量PCR檢測患者信號結合T細胞受體刪除環(huán)(signal-joint TRECs,sjTREC),了解患者胸腺輸出功能。
　　5、T細胞受體(T cell receptor,TCR)譜系分析:取病人外

11、周血,密度梯度離心分離單個核細胞,提取RNA。對于移植中出現aGVHD的6例患者,應用RT-RCR的方法擴增其移植前及移植后1個月、3個月的TCRVβ24個亞家族的序列,并通過基因掃描的方法了解其亞家族的克隆表達情況。
　　6、CD4+T細胞總體功能分析:采用ImmuKnow方法,按照試劑盒提供的步驟,免疫磁珠分離CD4+T細胞后,用植物血凝素(phytohem agglutinin,PHA)刺激,18小時后裂解細胞,測定細胞內A

12、TP含量,以評估T細胞總體功能。依據ATP含量,將免疫反應分為高度(>525ng/mL)、中度(226–524ng/mL)和低度(<225ng/mL)三個水平。
　　7、統(tǒng)計學分析:使用SPSS.18軟件進行Mann-Whitney檢驗、Spearman秩相關分析等統(tǒng)計學分析。
　　研究結果：
　　1、我們采用的靜脈輸注ATG體內去除T細胞的Haplo-HSCT方式,31例患者均未發(fā)生排斥。31例患者粒細胞植入中位時間

13、為(17.16±4.75)d,27例患者血小板植入中位時間為(30.59±18.05)d,3例高危和1例標危患者至死亡血小板仍未植入;移植后100天內發(fā)生Ⅱ~Ⅳ度aGVHD13例(42%),其中Ⅲ~Ⅳ度3例(9.7%);移植后早期31例患者均有不同程度的感染,肺部感染13例(42%);31患者中死亡12人,其中7例死于復發(fā),2例死于感染,2例死于急性GVHD。
　　2、移植前CD3+T細胞數為710±286.51/μL,移植后1個

14、月降至372.85±313.52/μL,3個月升為1071.36±664.30/μL,6個月升至1393.32±857.89/μL。移植前CD4+T細胞數為277.24±124.49/μL,移植后1個月降至57.67±49.11/μL,3個月時升為178.04±148.93/μL,6個月升至210.19±130.74/μL;移植前CD8+T細胞平均值為396.36±210.23/μL,移植后1個月降至258.87±229.65/μL,3

15、個月升為701.73±492.82/μL,6個月為升至879.11±566.40/μL;移植前CD4+CD45RA+CD62L+T細胞數為55.261±44.17/μL,移植后1個月降至1.95±2.72/μL,移植后3個月上升為4.69±5.62/μL,6個月升至23.08±37.04/μL;移植前CD8+CD45RA+CD62L+T細胞數為135.74±42.31/μL,移植后1個月為降至15.95±16.90/μL,3個月開始上升

16、為70.57±47.61/μL,6個月升至176.09±222.18/μL。移植前CD4+CD45RO+T細胞數為203.61±101.44/μL,移植后1個月為46.56±42.08/μL,3個月為171.67±141.64/μL,6個月升至176.73±104.53/μL;移植前CD8+CD45RO+T細胞數為165.94±102.67/μL,移植后1個月為177.10±167.71/μL,3個月為523.23±415.34/μL,

17、6個月升至437.63±410.09/μL;CD4+CD25+FOXP3+T細胞數為18.34±10.32/μL,移植后1個月為2.44±2.16/μL,3個月為9.84±11.12/μL,6個月為9.96±9.26/μL。
　　3、發(fā)生aGVHD組在監(jiān)測時間點CD4+T和CD8+T細胞數略高于無aGVHD組,但差異無統(tǒng)計學意義;發(fā)生aGVHD組記憶T細胞和初始T細胞數高于無aGVHD組,但僅在移植后1個月時CD8+記憶T和CD8

18、+初始T細胞間的差異有統(tǒng)計學意義。移植后1個月時,無aGVHD組Treg細胞數高于aGVHD組,其差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0097)。
　　4、22例接受Haplo-HSCT的患者移植前外周血sjTREC水平為78.72149±135.0016拷貝/105PBMC,8例供者為699.4644±1221.6469拷貝/105PBMC,兩者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。22例患者移植后1個月sjTREC水平為20.0129±2

19、6.700拷貝/105PBMC,3個月為25.4031±29.7042拷貝/105PBMCs,6個月為21.5883±17.4021拷貝/105PBMC?；颊咭浦睬巴庵苎猻jTREC水平與移植后6個月內sjTREC水平無明顯相關,Spearman相關系數分別為:0.278,0.467,0.714;相應的P值分別為:0.279,0.205,0.111。有aGVHD組與無aGHVD組移植后早期外周血sjTREC水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.

20、05)。
　　5、1例健康供者TCRVβ24個亞家族的基因掃描圖示亞家族完整、圖型分布多符合高斯分布;6例患者移植前有較多的亞家族缺失,存在的亞家族譜系形態(tài)也不是高斯分布,較多出現雙峰和寡克隆?；颊咭浦埠蠊芽寺”嚷食手饾u增高趨勢。
　　6、25例患者Haplo-HSCT前CD4+T細胞ATP含量為210.44±94.71ng/mL,移植后1個月降至181.87±121.63ng/mL,其后逐漸恢復,移植后3個月恢復至正常水平

21、,為274.51±119.31ng/mL,移植后6個月升至336.50±98.63ng/mL。移植后發(fā)生肺部感染組的ATP值在移植前已經低于無肺部感染組,在移植后不同時間點也低于未發(fā)生感染者;發(fā)生aGVHD者在移植前的ATP值已經高于無aGVHD組,在移植后不同時間點也高于未發(fā)生aGVHD者;復發(fā)組在移植前和移植后不同時間組的ATP值均低于未復發(fā)組。
　　結論：
　　1、我們采用的靜脈輸注ATG體內去除T細胞,G-CSF動員

22、的骨髓和外周血干細胞聯合移植的單倍體相合造血干細胞移植的方式,無一例排斥,安全可行。aGVHD發(fā)生率與國內同行報道相似,復發(fā)感染是其主要死亡原因。
　　2、Haplo-HSCT術后CD8+T細胞數量恢復早于CD4+T細胞;記憶T細胞重建早于初始T細胞,尤其是CD4+初始T細胞,在移植后6個月時仍未恢復。Treg細胞數在Haplo-HSCT后恢復緩慢,移植后6個月時才僅恢復至移植前50%左右。aGVHD對移植后早期CD4+T和CD8

23、+T細胞數無明顯影響。Treg可能會抑制aGVHD的發(fā)生。
　　3、Haplo-HSCT前患者的胸腺輸出功能已經受損,在移植后6個月,胸腺功能仍未恢復。aGHVD對移植后早期的外周血sjTREC水平無明顯影響。
　　4、Haplo-HSCT前患者即存在TCRβV亞家族缺失和寡克隆,提示移植前患者處于免疫病理狀態(tài);6例發(fā)生aGVHD的患者,Haplo-HSCT后均存在亞家族的缺失和寡克隆的表達,且其寡克隆比率較移植前增高?？赡?/p>

24、與移植后時間較短,患者胸腺依賴途徑的T細胞尚未免疫重建有關;也可能與aGVHD的發(fā)生及其治療用了大劑量免疫抑制劑有關。
　　5、Haplo-HSCT后1個月時患者CD4+T細胞功能下降,移植后3個月時恢復正常;Haplo-HSCT后發(fā)生肺部感染和復發(fā)組病例的CD4+T細胞功能,在移植前后均低于無感染和復發(fā)組;而發(fā)生aGVHD組的ATP值在移植前后不同時間點均高于無aGVHD組。提示CD4+T細胞功能有可能預測感染復發(fā)及aGVHD的