增生性瘢痕中P物質(zhì)的效應(yīng)與機制研究.pdf

1、目的：增生性瘢痕(HyperplasticScar，HS)是人類皮膚受損后出現(xiàn)的一種病理現(xiàn)象，更是燒傷后康復的一大難題，其發(fā)病機制至今尚不十分清楚。有研究顯示神經(jīng)肽P物質(zhì)(SubstanceP，SP)與瘢痕增生瘙癢密切相關(guān)，但其作用效應(yīng)及機制不清，本實驗從以下幾方面進行研究：1.SP對HS成纖維細胞(fibroblast,FB)增殖、活力和膠原合成的影響和量效關(guān)系，對肥大細胞(mastcell，MC)組胺釋放的影響和量效關(guān)系；2.SP對

2、成纖維細胞增殖與凋亡相關(guān)基因的作用情況；3.β-catenin蛋白在HS組織中含量與細胞內(nèi)定位的情況，以推測其在瘢痕增生中的作用；4.SP是否可以對成纖維細胞的β-catenin表達產(chǎn)生調(diào)控作用，探討SP促進成纖維細胞增殖的發(fā)生機制；5.應(yīng)用SP受體拮抗劑對SP的作用加以干預(yù)，研究拮抗劑對SP作用的阻斷效果，為研發(fā)抗瘢痕增生藥物打下基礎(chǔ)。 方法：收集HS及正常皮膚(normalskin，NS)組織，組織塊分離培養(yǎng)成纖維細胞，分別

3、進行實驗。1.應(yīng)用免疫組化方法觀察SP神經(jīng)纖維在HS和NS組織中的形態(tài)，以及SP在HS和NS分離培養(yǎng)的成纖維細胞中的表達；通過細胞計數(shù)、MTT法測定細胞增殖和活力、3H-脯氨酸攝入測定SP對其膠原代謝的影響；觀察HS成纖維細胞經(jīng)過SP作用后電鏡的形態(tài)學改變。2.應(yīng)用不同時間和劑量的SP及不同濃度的Ca2+作用于人HS中肥大細胞，用免疫熒光法測定組胺的釋放率，免疫組化及甲苯胺藍研究HS中SP神經(jīng)纖維和肥大細胞的改變和形態(tài)關(guān)聯(lián)，光鏡及電鏡研

4、究HS中肥大細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變。3.免疫組化染色檢測HS及NS中增殖細胞核抗原PCNA、c-myc原癌基因、Bcl-2凋亡抑制基因及Bax凋亡促進基因蛋白的表達情況；TUNEL法行細胞凋亡原位檢測；分離培養(yǎng)細胞檢測SP及其受體拮抗劑對PCNA、c-myc、Bcl-2和Bax蛋白的作用以及細胞的凋亡情況。4.應(yīng)用免疫組化方法及原位雜交方法檢測HS及NS組織中β-catenin蛋白的表達情況及細胞內(nèi)β-catenin蛋白的定位。5.S

5、P及其受體拮抗劑作用于成纖維細胞后，檢測β-catenin基因及蛋白表達情況。 結(jié)果： 1.在HS中，SP神經(jīng)纖維分布顯著高于NS。 2.SP可以促進HS成纖維細胞增殖和活力，促進成纖維細胞的膠原合成，可引起HS成纖維細胞的超微結(jié)構(gòu)改變。 3.SP對HS作用條件從SP低濃度1×10-6M即可開始起作用。 4.HS中SP與MC密切關(guān)聯(lián)，呈“串珠”樣形態(tài)。與NS相比，HS中的SP和MC在數(shù)量、形態(tài)、相

6、互的作用及聯(lián)系等多個方面均存在顯著差異。 5.HS中SP對MC作用強于NS，MC脫顆粒組織胺釋放存在SP劑量和時間依賴性，并且SP對MC作用受鈣離子濃度影響。 6.PCNA、c-myc和Bcl-2在HS中的陽性細胞率顯著高于NS組織，而Bax在HS中的陽性細胞率顯著低于NS組織。 7.在HS組織中凋亡細胞率低于NS組織。 8.SP可以增強PCNA、bcl-2和c-myc基因表達，抑制bax基因，抑制細胞凋

7、亡，從而促進瘢痕的增殖。此作用可被其受體拮抗劑阻斷。 9.在HS中β-catenin的蛋白水平和mRNA水平均顯著高于NS組織。 10.NS和HS中β-catenin在細胞中表達部位不同，NS中β-catenin多表達于胞膜上，而HS中出現(xiàn)顯著的β-catenin胞漿及胞核的異位聚集。 11.SP可以誘導成纖維細胞的β-catenin基因及蛋白表達上調(diào)。 12.SP誘導成纖維細胞β-catenin表達作用

8、可基本被其受體拮抗劑阻斷。 結(jié)論： 1.SP有促成纖維細胞增殖和膠原合成的作用以及促肥大細胞組胺釋放的作用，參與HS的增殖過程和瘙癢癥狀的產(chǎn)生。 2.SP從低濃度1×10-6M即可促成纖維細胞增殖和肥大細胞組胺釋放。 3.PCNA、c-myc、Bcl-2和Bax參與了瘢痕增殖與凋亡的過程，并且瘢痕增生與其細胞凋亡受到抑制相關(guān)。 4.SP可以增強PCNA、bcl-2和c-myc表達，抑制bax表達，