β-內啡肽及其受體在增生性瘢痕感覺異常發(fā)生中的分子機制及相關研究.pdf

1、背景:
　　 全世界每年約有1億多創(chuàng)傷患者發(fā)生病理性的瘢痕增生。過度增生的瘢痕屬于一種皮膚纖維的增生性疾病，多由燒傷、撕裂傷、摩擦傷、手術損傷、洞穿性損傷和預防接種等各類創(chuàng)傷造成創(chuàng)面的病理性愈合而產生，因為有真皮深層的損傷，這些患者往往伴有瘙癢、疼痛和攣縮等癥狀，其中尤以瘙癢與灼痛兩種感覺異常最為常見。既往研究表明，燒傷患者中87％的成人和100％的兒童都受到以上兩種癥狀的影響，其中有73.3％的患者表現(xiàn)為癢，67.6％的患者則

2、表現(xiàn)有明顯的為痛感。瘢痕增生早期，瘙癢越重，瘢痕增厚越快，如此形成惡性循環(huán)，嚴重影響了增生性瘢痕患者的生活質量。
　　 病理性愈合的瘢痕組織出現(xiàn)瘙癢與疼痛等感覺異常來源于細小類神經纖維。而這些細小類纖維在表皮與真皮不正常的結構狀態(tài)可能對修復細胞表面受體和細胞外配體產生影響。感覺神經肽是架起神經與非神經系統(tǒng)之間聯(lián)系的橋梁，在維持著皮膚完整性和參與組織重建等多個環(huán)節(jié)起作用。但是，既往更多探討神經肽中的P物（substanceP，SP

3、）、降鈣素基因相關肽（calcitoningene-relatedprotein,CGRP）及其受體(Neurokininreceptor，NKR)對創(chuàng)面愈合的影響，也包括神經營養(yǎng)因子、神經生長因子及其受體的研究結果。雖然獲得一些進展，但對病理性愈合狀態(tài)下感覺紊亂的探討幾乎是空白。
　　 近來人們發(fā)現(xiàn)，皮膚還表達另一類較為特殊的神經肽即阿片肽，主要有β-內啡肽(beta-endorphin)、腦啡肽(Enkephalin,Enk

4、)和強啡肽(Dynorphins，Dyn)等亞型。人皮膚的角質形成細胞產生β-內啡肽，同時該受體陽性的角質形成細胞簇擁在無髓神經纖維終末端周圍。因此，阿片受體系統(tǒng)同樣參與神經與皮膚之間的直接聯(lián)系，成為人們關注的對象。
　　 有研究顯示，除了已知的功能，mu型(μ-opioidreceptor,MOR)、delta型(δ-opioidreceptor，DOR)和kappa型(κ-opioidreceptor，KOR)三種阿片受體具

5、有調節(jié)非神經元細胞的功能，包括它們的免疫活性和各種生理功能。角質形成細胞主要表達MOR。而皮膚真皮層的成纖維細胞膜表面表達的阿片肽受體與角質形成細胞不同，其主要為DOR和KOR。這似乎與皮膚的痛癢“分層假說”相契合。
　　 程飚等人將病理性瘢痕與正常皮膚對照，采用免疫熒光染色及PT-PCR證實:β-內啡肽和MOR在角質形成細胞和成纖維細胞均表達，在正常皮膚中表皮內僅有少量的β-內啡肽，角質形成細胞表達的阿片受體也較少，可能參與傳

6、遞皮膚的“癢”和“痛”感覺。損傷后，再上皮化的表皮細胞和激活狀態(tài)的成纖維細胞表型發(fā)生改變，同時可能受神經纖維與末梢的影響，β-內啡肽分泌和分布異常，而有限的阿片受體難以將他們完全結合。當創(chuàng)傷愈合形成瘢痕組織時，特別是在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織表皮和真皮層中出現(xiàn)，“剩余”的阿片肽分泌增多或其受體表達上調，二者發(fā)生不匹配。阿片受體各亞型在人正常皮膚與增生性瘢痕組織中的表達具有不同的分布特征，它們可能是在造成瘢痕愈合后感覺異常的重要因素。同時

7、，三種亞型阿片受體的表達遠遠高于正常皮膚組織。初步證實了內源性阿片肽及其受體病理性瘢痕感覺異常有關。我們推測阿片系統(tǒng)在皮膚中以自分泌和旁分泌的形式影響表皮與真皮的角質形成細胞、成纖維細胞和免疫細胞生物學性質的改變，在多種阿片肽及其各自受體的時空表達上發(fā)生異常，從而釋放出各類細胞因子（如白介素等）和組織胺等介質，于是出現(xiàn)感覺異常。目前，內源性阿片肽及其多種阿片類受體亞型的研究多集中在皮膚急慢性、過敏性炎癥疾病中，有關內啡肽-阿片類受體在組

8、織愈合后，病理性瘢痕中的表達特點及變化規(guī)律尚未見報道。闡明各類型阿片肽在真表皮中的表達特點，不同阿片受體亞型的作用規(guī)律及彼此的相互關系，可能是揭示病理性瘢痕感覺紊亂機制的關鍵。
　　 目的:
　　 1、選擇內源性阿片肽（β-內啡肽、腦啡肽和強啡肽）及其它們各類受體亞型(μ-opioidreceptor,δ-Opioidreceptor，κ-Opioidreceptor)為主要觀察對象，進一步確立阿片肽與病理性創(chuàng)面愈合結局

9、的關系;
　　 2、選擇有痛癢的增生性瘢痕患者，觀察內源性阿片肽及其受體亞型在體即時表達的規(guī)律及差別以及各類阿片肽受體拮抗劑對感覺變化的影響作用。為病理性瘢痕患者感覺異常的發(fā)生機制及治療開拓新思路。
　　 方法:
　　 1、β-內啡肽、腦啡肽、強啡肽含量在大鼠單純皮膚瘙癢模型中動態(tài)變化的測定。取成年SD大鼠，皮下注射右旋糖酐溶液(60mg:1ml)0.2ml，成功建立皮膚瘙癢模型;大鼠麻醉后，腹部皮膚備皮，微滲析

10、探針穿過皮下，以生理鹽水作為滲析液，分別收集大鼠在正常生理狀態(tài)下、注射右旋糖酐后、同時注射納曲酮和右旋糖酐后三種狀態(tài)下的滲析液樣品，收集每種狀態(tài)下3個小時內共10個樣品。用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linkedimmunosorbentessay，ELISA)法測定每個樣品中β-內啡肽、腦啡肽、強啡肽的含量，觀察其在不同狀態(tài)下三種阿片肽含量的動態(tài)變化。
　　 2、瘢痕組織中β-內啡肽、腦啡肽、強啡肽及其相應受體的表達與含量測定

11、。將2010年4月-2011年9月間獲取的感覺異常明顯的42例增生性瘢痕組織(分為三組:A組:沒有痛癢組(n=20)，B組:單純癢組(n=14)和C組(n=8):有痛癢組）與5例正常皮膚組織（既無痛且無癢，D組），采用免疫熒光染色觀察β-內啡肽表達定位情況;同時，將標本制成勻漿用ELISA法檢測勻漿中β-內啡肽、腦啡肽、強啡肽的含量。另將9例痛或癢癥狀明顯的增生性瘢痕患者分為四組（有痛和癢、單純癢、單純痛和沒有痛癢），實時熒光定量技術(

12、Real-timequantitativepolymerasechainreaction,PT-PCR)分別檢測各組瘢痕組織中MOR、KOR和DOR的mRNA表達水平。
　　 3、微滲析針檢測在體情況下阿片肽在皮膚中的含量變化規(guī)律及阿片肽拮抗劑的應用。征集4名增生性瘢痕患者，病變部位組織色紅、質硬、突出皮面，且痛癢癥狀明顯。選取每名患者“痛癢”最為明顯的瘢痕局部，常規(guī)消毒。瘢痕下4-7mm穿刺入微滲析探針，長約4cm，注射器抽取

13、生理鹽水2.5ml，排氣后置入微滲析泵，將探針與注射器連接，探針尾部接集液管。收集10小時內共3個樣品。以每名患者自身正常皮膚作為對照，重復上述操作。將收集的所有樣品用ELISA法測定每個樣品中β-內啡肽、腦啡肽、強啡肽的含量。指導患者在瘙癢明顯的增生性瘢痕局部涂抹0.02％納曲酮TAT凝膠，2/日，持續(xù)一周。用藥前后分別用痛癢線性模擬標尺(visualanaloguescale)測定每個患者的“痛癢”指數(shù)及觀察瘢痕局部的變化。

14、　　 4、統(tǒng)計學方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，多樣本比較采用單因素方差方析，兩兩比較采用LSD法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、向大鼠注射右旋糖酐即成功建立大鼠皮膚瘙癢模型后，皮膚中各類阿片肽均發(fā)生改變但較穩(wěn)定的是β-內啡肽，其含量明顯升高的，且高于正常生理狀態(tài)下的含量。同時注射右旋糖酐和阿片肽拮抗劑納曲酮后發(fā)現(xiàn)β-內啡肽有下降的趨勢。
　　 2、人正常皮膚組織和

15、瘢痕組織中均可見β-內啡肽表達，在真皮層的周圍神經末梢、成纖維細胞和單核樣細胞等處。同時在表皮部分角質形成細胞呈陽性，且主要表達在細胞膜上，并且單純癢組和痛癢組β-內啡肽表達明顯強于無痛癢組。
　　 3、三種阿片肽在正常皮膚與增生性瘢痕組織中均有表達。各組β-內啡肽含量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=24.604，P＜0.001)，且各增生性瘢痕組織中的β-內啡肽含量均顯著高于正常皮膚組。B組β-內啡肽含量顯著高于A組(P=0.001

16、)和C組(P=0.008);A組與C組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.881)。各組Enk含量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=2.918，P=0.045)，其中A組(P=0.011)、B組(P=0.008)Enk含量顯著高于正常皮膚組，其余各組間Enk含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各組Dyn含量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=3.729，P=0.018)，各增生性瘢痕組Dyn含量均顯著高于正常皮膚組，其余各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

17、
　　 4、MOR、KOR和DOR在增生性瘢痕組織中均有表達。在MOR的mRNA表達水平中，痛癢組瘢痕組織中mRNA含量高于其余各組;在KOR的mRNA表達水平中，單純痛與痛癢組瘢痕組織中mRNA含量高于其余兩組;在DOR的mRNA表達水平中，單純痛與痛癢組瘢痕組織中mRNA含量高于其余各組。
　　 5、在體情況下增生性瘢痕組織液中β-內啡肽(t=-4.017，P=0.001)、Enk(t=-5.495，P＜0.001)

18、含量較正常皮膚明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義;增生性瘢痕組織液與正常皮膚組織液中強啡肽含量差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.100，P=0.271)?；颊呔植渴褂眠x擇性阿片肽拮抗劑——納曲酮后痛癢指數(shù)較用藥前降低。
　　 結論:
　　 1、皮膚瘙癢的發(fā)生與阿片肽及其受體相關。
　　 2、三種阿片肽β-內啡肽、強啡肽、腦啡肽及其相應受體亞型MOR、KOR和DOR均參與增生性瘢痕患者的感覺異常的發(fā)生，其中β-內啡肽及MOR與