二甲胺四環(huán)素對大鼠脊髓繼發(fā)性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、急性脊髓損傷(spinalcardinjury，SCI)后其病理發(fā)展由兩種損傷機(jī)制主導(dǎo)，即原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷被動(dòng)地發(fā)生在損傷后短時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)生的神經(jīng)損傷是不可逆轉(zhuǎn)的；繼發(fā)性損傷主要表現(xiàn)為興奮性死亡和凋亡二種形式，在創(chuàng)傷后幾小時(shí)、幾天或更長時(shí)間發(fā)生，是由多種因素所致，是一個(gè)可逆的且可控制的復(fù)雜的自我破壞級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，是加重神經(jīng)功能障礙的主要原因，其具體機(jī)制仍末明晰。 目前已發(fā)現(xiàn)在腦、脊髓缺血性和機(jī)械性損傷模型中，廣泛

2、存在DNA損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄水平修復(fù)、相關(guān)基因表達(dá)等。而如何抑制促神經(jīng)細(xì)胞凋亡的基因、生物因子，以及如何增加抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的基因、生物因子，并及早識(shí)別細(xì)胞早期凋亡的特征，挽救瀕臨死亡的神經(jīng)元己成為今后研究重點(diǎn)之一。細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因可分為凋亡促進(jìn)基因和凋亡抑制基因。目前研究認(rèn)為bcl-2可以抑制由多種細(xì)胞毒素所引起的細(xì)胞死亡，bcl-2的過度表達(dá)能增強(qiáng)所觀察細(xì)胞對大多數(shù)細(xì)胞毒素的抵抗性。這一發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識(shí)到調(diào)亡的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、途徑有一個(gè)共同的通路成交匯點(diǎn)，而該通路成交匯點(diǎn)可能受bcl-2調(diào)節(jié)。而bax蛋白屬于bcl-2家族，基本生物功能是促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。caspase-3是凋亡促進(jìn)基因，是凋亡過程中最重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，它與bcl-2在凋亡調(diào)控中的相互關(guān)系比較復(fù)雜。 二甲胺四環(huán)素(Minocycline)屬第二代半合成的四環(huán)素類藥物，脂溶性較高，且可透過血腦屏障，在四環(huán)素類中抗菌作用最強(qiáng)

4、，具有高效和長效性質(zhì)。二甲胺四環(huán)素不僅有強(qiáng)大的抗菌作用，并且有明顯的抗炎效果。近年來有研究表明其對腦組織缺血有明顯的神經(jīng)保護(hù)功能。二甲胺四環(huán)素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的神經(jīng)保護(hù)作用確切機(jī)制尚不十分清楚，有多種可能，其中一種可能是二甲胺四環(huán)素的抗細(xì)胞凋亡作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，二甲胺四環(huán)素可以明顯降低caspase-1和caspase-3mRNA的表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因Huntington’s疾病動(dòng)物模型的生存率。有研究通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)用二甲胺四

5、環(huán)素治療后，能提高大鼠IL-10的mRNA的表達(dá)，降低TNF-α表達(dá)，減少細(xì)胞死亡，促進(jìn)下肢功能的康復(fù)。目前國內(nèi)關(guān)于二甲胺四環(huán)素對SCI的神經(jīng)保護(hù)作用的研究報(bào)道甚少。 目的 1.探討大鼠SCI后損傷區(qū)脊髓組織中bcl-2、bax和caspase-3基因的表達(dá)情況、變化規(guī)律及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 2.探討二甲胺四環(huán)素對大鼠SCI后損傷區(qū)脊髓組織中bcl-2、bax和caspase-3的表達(dá)的影響。 3.探討二

6、甲胺四環(huán)素對大鼠SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。 方法 1.利用改良Allen’s打擊法制作大鼠脊髓不完全損傷模型。 2.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法和Western印記分析(Westernblot)法檢測SCI后不同時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)脊髓組織中bcl-2、bax和caspase-3mRNA和蛋白含量的表達(dá)。用TUNEL方法檢測SCI后不同時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)脊髓組織中細(xì)胞凋亡情況。 3.對SCI大鼠，分別

7、給予二甲胺四環(huán)素(MIN)或生理鹽水(SAL)治療，用RT-PCR法和免疫組織化學(xué)染色(SABC)法檢測傷后不同時(shí)間點(diǎn)損傷區(qū)脊髓組織中bcl-2、bax和caspase-3mRNA和蛋白含量的表達(dá)。 4.對SCI大鼠，分別給予二甲胺四環(huán)素、生理鹽水和甲基強(qiáng)的松龍(Methylprednisolone，MP)治療，在傷后不同時(shí)間點(diǎn)(1～28d)用斜板試驗(yàn)、BBB評(píng)分對大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能觀測，并用免疫熒光法檢測傷后4周脊髓組織損傷尺寸

8、大小。 結(jié)果 1.bcl-2、bax和caspase-3mRNA無損傷脊髓組織中稍有表達(dá)。SCI后8h，bcl-2mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，3d達(dá)到高峰，與對照組比差異非常顯著(P＜0.01)，7d后開始下降，21d接近對照組水平；baxmRNA4h后即有明顯表達(dá)(P＜0.05)，1～3d達(dá)到高峰，7d仍有持續(xù)較高表達(dá)，持續(xù)至傷后14d，與對照組比差異非常顯著(P＜0.01)，傷后21d起表達(dá)減弱，并接近對照

9、組水平；caspase-3mRNASCI后8h內(nèi)表達(dá)升高(P＜0.05)，3～7d表達(dá)達(dá)到高峰(與對照組比差異非常顯著，P＜0.01)，仍較高表達(dá)持續(xù)至傷后14d(與對照組比差異顯著P＜0.01)，傷后21d表達(dá)接近對照組水平。 2.bcl-2、bax和caspase-3蛋白表達(dá)在無損傷脊髓組織中低。SCI后8h，bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，3d達(dá)到高峰，與對照組比差異非常顯著(P＜0.01)，7d后開始下降，21d接近對照組水

10、平；bax蛋白脊髓損傷4h后即有明顯表達(dá)，3d達(dá)到高峰，7d仍有持續(xù)較高表達(dá)，持續(xù)至傷后14d，與對照組比差異非常顯著(P＜0.01)，傷后21d起表達(dá)減弱，并接近對照組水平；caspase-3酶原蛋白SCI后8h內(nèi)表達(dá)升高，3～7d表達(dá)達(dá)到高峰(與對照組比差異非常顯著，P＜0.01)，仍較高表達(dá)持續(xù)至傷后14d，照組比差異顯著(P＜0.05)；caspase-317kD亞單位在對照組無表達(dá)，SCI后4h出現(xiàn)表達(dá)，3～7d表達(dá)達(dá)到高峰(

11、與對照組比差異非常顯著，P＜0.01)，傷后21d仍有表達(dá)。 3.無損傷對照組有微量的凋亡細(xì)胞。損傷組傷后4h損傷部位開始少量出現(xiàn)陽性表達(dá)，傷后8h數(shù)量增加(P＜0.05)，此后陽性細(xì)胞逐漸增多，3～7d達(dá)高峰(P＜0.01)，14d仍有表達(dá)，傷后3周陽性表達(dá)與對照組無顯著差異(P＞0.05) 4.二甲胺四環(huán)素治療組，脊髓損傷后8h，bcl-2mRNA表達(dá)高于SAL對照組(P＜0.05)，1d，3d，7d各時(shí)間點(diǎn)bcl-

12、2mRNA表達(dá)明顯增加，與SAL對照組比差異非常顯著(P＜0.01)；傷后8h，1d，3d，7d，21d各時(shí)相點(diǎn)二甲胺四環(huán)素治療組baxmRNA表達(dá)與SAL對照組比無顯著性差異(P＞0.05)；傷后8h，1d，3d，7d各觀察時(shí)間點(diǎn)，二甲胺四環(huán)素治療組caspase-3mRNA表達(dá)明顯低于SAL對照組，與SAL對照組比差異非常顯著(P＜0.01)，SCI后21d，二甲胺四環(huán)素治療組caspase-3mRNA亦低于對照組(P＜0.05)。

13、 5二甲胺四環(huán)素治療組，脊髓損傷后8h，1d，3d，7d，21d各觀察點(diǎn)bcl表達(dá)陽性細(xì)胞明顯多于SAL對照組，與SAL對照組比差異非常顯著(P＜0.05，P＜0.01)；傷后各時(shí)間點(diǎn)二甲胺四環(huán)素治療組bax陽性表達(dá)細(xì)胞與SAL對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。傷后各觀察時(shí)間點(diǎn)，二甲胺四環(huán)素治療組caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞明顯少于SAL對照組，與SAL對照組比差異非常顯著(P＜0.05，P＜0.01)。 6.二

14、甲胺四環(huán)素治療組，傷后7～28d，大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分明顯高于SAL對照組，與對照組比差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)；大鼠SCI傷后4周，脊髓損害面積明顯小于SAL對照組，與對照組比差異非常顯著(P＜0.01)；二甲胺四環(huán)素治療組與MP治療組后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較，兩組無顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論 1.急性SCI后，損傷區(qū)脊髓組織中bcl-2、bax和caspase-3mRNA及蛋白水平明顯升高，與細(xì)胞凋亡

15、有明顯的相關(guān)性，提示bcl-2、bax和caspase-3在脊髓繼發(fā)性損傷過程中起重要作用。 2.二甲胺四環(huán)素能明顯抑制SCI后損傷區(qū)脊髓組織中促凋亡基因caspase-3的表達(dá)，上調(diào)抑凋亡基因bcl-2的表達(dá)，表明甲胺四環(huán)素能減輕SCI后損傷局部的細(xì)胞凋亡。 3.二甲胺四環(huán)素能明顯減少SCI后的損傷范圍并促進(jìn)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，提示二甲胺四環(huán)素在脊髓繼發(fā)性損傷過程中具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，是SCI后藥物治療可能的理