棗樹ZjPIP2、ZjGPX和ZjMT基因的序列分析與表達研究.pdf

1、不同植物對逆境脅迫具有不同的耐受性，不同的耐受性產(chǎn)生于進化過程中形成的基因應(yīng)激調(diào)控機制?？寺『脱芯靠鼓嫘曰?qū)τ谖覀兞私庵参锏目鼓鏅C制和改良植物品種具有重要的意義。棗樹（ZiziphusjujubaMill）原產(chǎn)于我國黃河流域，它耐寒，抗旱，抵御各種外界不良因子的能力強，尤其是對土壤瘠薄、干旱的忍耐力顯著優(yōu)于其它農(nóng)作物。因此，棗樹的抗逆性基因是非常寶貴的遺傳資源，為了挖掘和研究棗樹有關(guān)抗逆基因，本研究以壺瓶棗為試材，從其結(jié)果枝cDNA文

2、庫中篩選并克隆獲得了水通道蛋白基因、谷胱甘肽過氧化物酶基因、金屬硫蛋白基因，分別對這些基因的序列進行了生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了相應(yīng)的原核及植物表達載體，并進行了相關(guān)表達研究及初步的功能驗證。
　　(1)棗樹水通道蛋白基因（ZjPIP2）的序列分析與表達研究:從棗樹結(jié)果枝cDNA文庫中篩選獲得了一個水通道蛋白基因，用生物信息學(xué)軟件對該基因cDNA序列進行分析，分析結(jié)果表明此序列全長為846bp，編碼281個氨基酸，分子量為29.87K

3、D，pI值為8.77;具有膜蛋白家族的保守氨基酸序列“HINPAVTFG”和兩個“NPA”保守肽段;與已知的其它植物的質(zhì)膜膜內(nèi)蛋白PIP2具有極高的同源性，將其命名為ZjPIP2（DDBJ/EMBL/GenBank的注冊號為:AB530493）。利用基因重組技術(shù)將ZjPIP2構(gòu)建至原核表達載體pGEX-4T-1及植物表達載體pBI121。通過熱激法將原核表達載體pGEX-4T-1-ZjPIP2轉(zhuǎn)入E.coliBL21，構(gòu)建了原核表達菌株

4、pGEX-4T-1-ZjPIP2-B。通過凍融法將植物表達載體pBI121-ZjPIP2轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404獲得了工程菌pBI121-ZjPIP2-L;該工程菌侵染擬南芥獲得轉(zhuǎn)ZjPIP2基因擬南芥植株。對壺瓶棗樹苗進行干旱、NaCl脅迫后進行RT-PCR分析結(jié)果表明，脅迫誘導(dǎo)了ZjPIP2的表達。
　　(2)棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因(ZjGPX)的序列分析與表達研究:利用生物信息學(xué)軟件對已獲得的谷胱甘肽過氧化物酶基因c

5、DNA序列進行分析，結(jié)果表明該cDNA序列的全長為510bp，編碼169個氨基酸，分子量為19.26KD，pI值為5.00，具有一個谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性位點“GKvLLIvNVaSkCGmT”及一個保守肽段“LAFPCNQF”，與其他植物的GPX有極高的同源性，將其命名為ZjGPX;它與白楊樹的GPX(2p5rA)有相似的三維結(jié)構(gòu)。將ZjGP基因片段構(gòu)建至原核表達載體pGEX-4T-2，獲得了原核表達載體pGEX-4T-2-

6、ZjGPX;將其轉(zhuǎn)入E.coliBL21后獲得了工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達和SDS-PAGE電泳分析證明，pGEX-4T-2-ZjGPX-B表達了大小約為45KD的融合蛋白GST-ZjGPX。并利用GST標簽蛋白純化樹脂純化獲得GST-ZjGPX融合蛋白。對壺瓶棗樹苗進行干旱、NaCl脅迫后的RT-PCR結(jié)果表明，ZjGPX在一定的環(huán)境脅迫被誘導(dǎo)表達。
　　(3)棗樹金屬硫蛋白基因(ZjMT)植物

7、表達載體的構(gòu)建與功能分析:根據(jù)已獲得的棗樹金屬硫蛋白基因ZjMT的cDNA序列設(shè)計并合成特異性引物，PCR擴增出ZjM基因片段，并將其構(gòu)建于植物表達載體PEZR(K)-LNY。凍融法將植物表達載體PEZR(K)-LNY-ZjMT轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得工程菌PEZR(K)-LNY-ZjMT-L;工程菌株轉(zhuǎn)化擬南芥，并獲得轉(zhuǎn)ZjMT因擬南芥植株。對轉(zhuǎn)ZjMT基因植株的細胞學(xué)觀察表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表皮細胞和氣孔保衛(wèi)細胞核有表