整合素β-,1-反義寡核苷酸治療胰腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究包括以下幾個(gè)方面：采用免疫組織化學(xué)方法分析胰腺癌組織中整合素β1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系；將靶向整合素β1的ASODN通過(guò)脂質(zhì)體導(dǎo)入到人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞中，觀察其對(duì)整合素β1mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用，研究胰腺癌細(xì)胞體外侵襲力改變；轉(zhuǎn)染整合素β1mRNAASODN后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和化療敏感性的改變；通過(guò)建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，進(jìn)一步觀察整合素β1ASODN在體內(nèi)的抑瘤效果和對(duì)靶基因表達(dá)的影響。 第一部分

2、整合素β1、蛋白激酶Cα在胰腺癌中的表達(dá)及其意義 目的 探討整合素β1和蛋白激酶Cα(proteinkinaseC，PKCα)在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義。 方法 采用免疫組織化學(xué)S-P方法，檢測(cè)56例胰腺癌及23例癌旁非腫瘤胰腺組織中整合素β1和PKCα的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 1.整合素β1胰腺癌組織和癌旁非腫瘤胰腺組織中高表達(dá)率分別為71.43％和43.48％，兩

3、者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；PKCα在胰腺癌組織和癌旁非腫瘤胰腺組織高表達(dá)率分別為62.50％和21.74％，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 2.整合素β1高表達(dá)與胰腺癌TNM分期(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)有關(guān)。 3.PKCα高表達(dá)與胰腺癌分化程度(P＜0.05)、TNM分期(P＜0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。 4.在胰腺癌組織中，整合素β1表達(dá)與PKCα表達(dá)呈正相

4、關(guān)(r=0.653，P＜0.05)。結(jié)論 1.整合素β1和PKCα的表達(dá)和/或功能異?？赡芄餐瑓⑴c胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。 2.聯(lián)合檢測(cè)兩種蛋白對(duì)于預(yù)測(cè)胰腺癌轉(zhuǎn)移潛能具有一定參考價(jià)值。 第二部分整合素β1反義寡核苷酸對(duì)人胰腺癌細(xì)胞體外侵襲力的影響 目的 觀察整合素β1反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides，ASODN)對(duì)人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞體外侵襲力的影響。

5、 方法 采用脂質(zhì)體將整合素β1ASODN轉(zhuǎn)染到人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reversetranscript-polymerasechainreaction，RT-PCR)、Western印跡法和Transwell侵襲室方法分別檢測(cè)細(xì)胞整合素β1mRNA、蛋白表達(dá)水平及體外侵襲能力。 結(jié)果 1.與對(duì)照組相比，32mg/L～128mg/LASODN轉(zhuǎn)染后可抑制整合素β1mRNA和蛋白的表達(dá)，其

6、中64mg/L和128mg/LASODN對(duì)整合素β1mRNA和蛋白的表達(dá)有非常顯著的抑制作用(P＜0.01)。 2.體外侵襲力檢測(cè)顯示，64mg/L整合素β1ASODN轉(zhuǎn)染后使胰腺癌細(xì)胞侵襲能力明顯下降。 結(jié)論 1.靶向整合素β1的ASODN可有效阻斷其在人胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。 2.靶向整合素β1的ASODN可降低胰腺癌細(xì)胞體外侵襲力。 第三部分整合素β1反義寡核苷酸對(duì)人胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和化療

7、敏感性的影響 目的 觀察整合素β1反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides，ASODN)對(duì)人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和對(duì)化療藥物敏感性的影響。 方法 采用脂質(zhì)體將整合素β1ASODN轉(zhuǎn)染到人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞中，MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率，AnnexinV-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。以有效轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染整合素β1ASODN24小時(shí)，給予梯度濃度5-氟尿嘧啶

8、、阿霉素和健擇，觀察量效關(guān)系，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(inhibitoryconcentration50％，IC50)。 結(jié)果 1.與對(duì)照組相比，32mg/L～128mg/LASODN轉(zhuǎn)染后可抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈量效依賴關(guān)系，64mg/L和128mg/L抑制作用最明顯。 2.轉(zhuǎn)染64mg/L整合素β1ASODN24h，細(xì)胞早期凋亡率為20.17±2.04％。 3.轉(zhuǎn)染整合素β1ASODN增加胰腺癌細(xì)胞對(duì)化

9、療藥物的敏感性，ASODN+化療組對(duì)各化療藥物的IC50均有顯著下降。 結(jié)論 1.靶向整合素β1的ASODN可有效抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。 2.靶向整合素β1的ASODN可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞早期凋亡。 3.靶向整合素β1的ASODN可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性。 第四部分整合素β1反義寡核苷酸對(duì)人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的治療作用 目的 觀察整合素β1反義寡核苷酸(antisenseoli

10、godeoxynucleotides，ASODN)對(duì)裸鼠人胰腺癌移植瘤生長(zhǎng)和基因表達(dá)的抑制作用。 方法 建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為三組給予不同條件處理：對(duì)照組(皮下注射脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)染液)，隨機(jī)序列(randomoligodeoxynucleotides，RODN)治療組(皮下注射RODN、脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)染液)，ASODN治療組(皮下注射ASODN、脂質(zhì)體和轉(zhuǎn)染液)。治療期間定期測(cè)腫瘤體積和裸鼠體重，計(jì)算抑瘤率和腫

11、瘤縮小率。采用RT-PCR和Western印跡法檢測(cè)治療后裸鼠腫瘤組織中整合素β1mRNA和蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 1.治療結(jié)束后，ASODN治療組、RODN治療組和對(duì)照組平均腫瘤體積分別為202.82±2.23mm3、702.34±11.64mm3和712.98±16.82mm3，ASODN治療組與對(duì)照組比較差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而RODN治療組和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。ASODN治療組、R

12、ODN治療組抑瘤率分別為1.49％和71.55％，ASODN治療組腫瘤縮小15.36％。各組裸鼠體重變化無(wú)明顯差別。 2.與對(duì)照組比較，ASODN治療組裸鼠腫瘤組織中整合素β1mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)。 結(jié)論 1靶向整合素β1的ASODN可在體內(nèi)抑制mRNA和蛋白表達(dá)。 2靶向整合β1的ASODN對(duì)人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)具有一定抑制作用。 3整合素β1ASODN成為一種