RNA氧化損傷檢測(cè)方法優(yōu)化及不同條件下細(xì)胞RNA氧化損傷分析.pdf

1、目的:RNA是細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的一類生物大分子,在基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯等方面發(fā)揮重要作用。研究表明在生理和病理?xiàng)l件下都存在RNA損傷,但卻一直沒有得到足夠重視,致使RNA損傷對(duì)細(xì)胞和機(jī)體造成的毒害作用被低估。最近有研究表明 RNA損傷可能參與神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展,因此對(duì)RNA損傷的認(rèn)識(shí)和研究將有助于對(duì)疾病發(fā)生機(jī)制的理解,并進(jìn)一步為相關(guān)疾病的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)和方法。本研究旨在建立并優(yōu)化細(xì)胞RNA氧化損傷的檢測(cè)方法,

2、分析不同條件下細(xì)胞和組織的RNA損傷狀況,并探索毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)征突變蛋白(ATM)在RNA損傷識(shí)別和修復(fù)機(jī)制中的作用。
　　方法:反轉(zhuǎn)錄阻斷聯(lián)合雙引物擴(kuò)增法:用過氧化氫(H2O2)處理非細(xì)胞體系和細(xì)胞體系RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)所檢測(cè) mRNA的5'端和3'端各設(shè)計(jì)一對(duì)引物,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,比較兩端PCR產(chǎn)物相對(duì)含量判斷RNA氧化損傷程度,損傷越嚴(yán)重則反轉(zhuǎn)錄生成完整cDNA的效率越低,相應(yīng)包含mRNA5'端的cD

3、NA含量越少。競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫法(ELISA):以 RNA主要氧化損傷產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤(8-OHG)作為競(jìng)爭(zhēng)性抗原包被于酶標(biāo)板內(nèi),與RNA損傷樣品競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體,通過測(cè)量酶標(biāo)板內(nèi)各孔OD450判斷RNA損傷狀況。采用ELISA方法檢測(cè)ATM野生型和突變型細(xì)胞RNA氧化損傷;將非氧化和H2O2氧化處理的RNA轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞,用Western blotting檢測(cè)ATM磷酸化及蛋白表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:以管家基因甘油醛

4、-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和p53 mRNA為檢測(cè)對(duì)象,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄阻斷聯(lián)合雙引物擴(kuò)增法檢測(cè)出非細(xì)胞體系和細(xì)胞體系氧化處理組mRNA損傷程度均明顯高于對(duì)照組,且隨著氧化劑H2O2濃度增加損傷增強(qiáng),同時(shí)一定限度內(nèi)降低反轉(zhuǎn)錄酶用量能提高檢測(cè)靈敏度。競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)到癌與癌旁組織、細(xì)胞衰老模型中存在氧化損傷RNA;同時(shí)檢測(cè)出HeLa細(xì)胞經(jīng)電離輻射后產(chǎn)生RNA氧化損傷,且損傷程度與輻射劑量成正相關(guān)。ATM突變型細(xì)胞較野生型細(xì)胞其 RNA