兩種中藥的化學(xué)成分對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抑制作用研究.pdf

1、在全球范圍內(nèi)，前列腺癌是繼肺癌之后的第二大癌癥。在發(fā)達(dá)國(guó)家，前列腺癌是導(dǎo)致男性死亡的第三大癌癥。近年來，前列腺癌的診斷和治療都取得了一些進(jìn)展，但對(duì)于那些雄激素非依賴性的前列腺癌，目前的治療方法都不能有效控制病情，且死亡率仍然較高，因此需要尋找更加有效的治療方法。從中藥和天然藥物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
　　目的：研究鴉膽子中苦木內(nèi)酯素類化合物（鴉膽子苦醇、鴉膽子苦素A和鴉膽子亭醇）對(duì)前列腺癌DU145

2、細(xì)胞的增殖抑制作用，并初步探討其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為治療前列腺癌的新藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)；評(píng)價(jià)了鐵筷子中的化合物對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞及PC3細(xì)胞增殖的抑制作用，并初步探討其構(gòu)效關(guān)系。
　　方法：采用MTT法檢測(cè)兩種中藥的化學(xué)成分對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株和前列腺癌細(xì)胞增殖的影響，并在顯微鏡下觀察鴉膽子苦醇(YD-1)、鴉膽子苦素A(YD-2)和鴉膽子亭醇(YD-3)這三個(gè)化合物對(duì)DU145細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響；應(yīng)用Hoechst

3、33258染色法以及DNA片段化法初步分析YD1—3誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況；采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)YD1—3對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平以及細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響；通過Western blot法檢測(cè)YD1對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP)表達(dá)的影響，檢測(cè)YD1—3對(duì)MAPK家族蛋白(ERK、JNK、P38)的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：YD1—3這三

4、個(gè)化合物均能夠抑制前列腺癌DU145細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和劑量依賴性的特點(diǎn)。三者的IC50分別為(0.37±0.03)μM、(0.60±0.19)μM、(0.41±0.03)μM；綜合Hoechst33258染色結(jié)果、DNA片段化分析結(jié)果以及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，YD1—3均可以誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡。Hoechst33258核染色結(jié)果顯示隨著化合物濃度的增加（0.0625、0.125、0.25、0.5μM，前列腺癌細(xì)胞DU1

5、45的細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)改變；DNA片段化實(shí)驗(yàn)觀察到DNA梯形條帶；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)YD1—2均可以引起細(xì)胞周期S期阻滯，YD-3可以引起細(xì)胞周期G2/M期阻滯；YD1—3分別處理12 h、24 h、48 h的細(xì)胞周期圖可以發(fā)現(xiàn)處理24 h時(shí)凋亡峰比例最大；經(jīng)0.25μM的YD-1、0.5μM的YD-2、0.3μM的YD-3處理24h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率分別為(10.6±1.1)％、(6.9±

6、0.8)%、(10.6±0.9)%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平和線粒體膜電位結(jié)果顯示，YD-1可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和線粒體膜電位的降低，提示線粒體途徑可能參與介導(dǎo)YD-1誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞發(fā)生凋亡；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)YD-1對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP）表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)逐漸降低，Bax蛋白的

7、表達(dá)逐漸增加，并且出現(xiàn)了Caspase-3的激活以及因激活而被剪切的PARP片段，說明YD-1誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)MAPK的磷酸化水平，結(jié)果顯示，YD1—3可以影響MAPK家族蛋白(ERK、JNK、P38)的表達(dá)。在鐵筷子中提取分離得到的單體化合物體外抑制前列腺癌細(xì)胞 PC3、DU145增殖活性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵筷子中19個(gè)單體化合物對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞和P

8、C3細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的增殖抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1. YD1—3這三個(gè)化合物均可以以劑量、時(shí)間依賴的方式抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞發(fā)生凋亡。YD-1誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的機(jī)制與激活JNK、P38信號(hào)通路，抑制ERK信號(hào)通路，造成線粒體功能紊亂，激活Caspase-3，最終引起PARP片段化有關(guān)。YD-2抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡可能與P38和ERK信號(hào)通路相關(guān)

9、，YD-3抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡可能與P38、JNK和ERK信號(hào)通路相關(guān)，其中ERK信號(hào)通路主要參與化合物抑制前列腺癌DU145細(xì)胞的增殖作用，而P38和JNK信號(hào)通路參與化合物誘導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡作用。
　　2.鐵筷子的19個(gè)單體化合物中，蟾毒內(nèi)酯類化合物對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖抑制作用，且蟾毒內(nèi)酯苷的細(xì)胞增殖抑制活性強(qiáng)于其相對(duì)應(yīng)的蟾毒內(nèi)酯苷元，A/B順式構(gòu)型的強(qiáng)心苷強(qiáng)于A/B反式構(gòu)型的強(qiáng)心苷，