羥基脲誘導(dǎo)的生精細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制研究.pdf

1、外源性化學(xué)(藥)物的生殖毒害作用逐漸引起人們的關(guān)注。近年來(lái)，隨著腫瘤患者生存期的延長(zhǎng)，抗腫瘤藥物的遠(yuǎn)期不良反應(yīng)也日益受到重視。羥基脲(HU)是目前惟一用于臨床的核糖核苷酸還原酶抑制劑類抗腫瘤藥，主要用于治療黑色素瘤、髓性白血病及卵巢腫瘤等，近年來(lái)，其治療適應(yīng)癥愈來(lái)愈廣泛，但到目前為止關(guān)于HU的雄性生殖毒性研究較少，而且主要集中于小鼠身上，未見(jiàn)系統(tǒng)的雄性生殖毒性研究資料。本研究在體外毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行整體動(dòng)物試驗(yàn)以評(píng)價(jià)HU對(duì)大鼠生殖系

2、統(tǒng)的毒性作用特點(diǎn)及毒性作用機(jī)制；最后，在確定HU引起大鼠的生精細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和分子毒理學(xué)技術(shù)深入探討了HU的睪丸毒性作用機(jī)制。 HU的體內(nèi)外生殖毒性：雄性大鼠睪丸Sertoli-種質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)試驗(yàn)表明，HU在0．001．0．1M濃度范圍內(nèi)，對(duì)睪丸生精細(xì)胞具有明顯毒性，隨著給藥濃度和時(shí)問(wèn)的增加，生殖細(xì)胞脫落率逐漸增加，細(xì)胞活性逐漸下降，LDH的漏出逐漸增加。孕13d大鼠胚胎中腦細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)顯示，HU可明顯抑制

3、中腦細(xì)胞的增殖和分化，阻止神經(jīng)細(xì)胞分化和集落形成，呈現(xiàn)劑量一效應(yīng)關(guān)系，對(duì)中腦細(xì)胞增殖、分化的半數(shù)抑制濃度(IVso和Dso)分別為0．018和0．078mM，兩者的比值為4．33，顯示HU可能具有強(qiáng)胚胎毒性。 整體動(dòng)物毒性試驗(yàn)表明，雄性Wistar大鼠分別連續(xù)10d給予100、200和400mg／kgHU后，從給藥D7天起，200rog／kg、400mg／kg組雄性大鼠體重明顯下降。停藥D9時(shí)，前列腺、精囊腺的重量和臟／體比有下

4、降趨勢(shì)，200mg／kg、400mg／kg組動(dòng)物附睪不活動(dòng)精子增加明顯。精子染色體結(jié)構(gòu)分析顯示評(píng)估人群生育潛能閾值的COMPat隨劑量增加而增加，病理組織形態(tài)學(xué)觀察顯示曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞缺失、脫落明顯，400mg／kg組部分管腔甚至出現(xiàn)大量多核巨細(xì)胞，附睪出現(xiàn)膿腫。停藥D23時(shí)，各個(gè)劑量組睪丸臟／體比都明顯下降，400mg／kg組附睪臟／體比下降明顯，并且仍然有大量不活動(dòng)精子，200mg／kg、400mg／kg組精子計(jì)數(shù)明顯減少；無(wú)論D

5、9和D23，各劑量組均有大量畸形精子。COMPat值的增加以及睪丸和附睪組織的病理?yè)p害，在停藥D23較D9更為嚴(yán)重，表明生育力受到嚴(yán)重傷害，而且在短期內(nèi)不能修復(fù)。雄鼠末次給藥后D2雌雄大鼠交配，孕D15剖殺孕鼠，對(duì)妊娠結(jié)局的檢查顯示各組孕鼠體重，子宮和卵巢的臟器系數(shù)和各組雌鼠在交配率、平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)和窩均活胎數(shù)和吸收率上沒(méi)有明顯差異，與400mg／kg組雄性大鼠交配的雌鼠受孕率明顯降低，活胎率降低，著床前丟失率明顯增加。

6、 綜合分析HU的一般生殖毒性研究的結(jié)果，HU生殖毒性作用的靶器官是睪丸和附睪，并對(duì)精子生成過(guò)程產(chǎn)生影響，停藥后一段時(shí)間內(nèi)毒性表現(xiàn)具有延遲性，400mg／kg組HU可以影響雌鼠受孕，并對(duì)早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生明顯影響，有一定的胚胎毒性，而對(duì)100mg／kg、200mg／kg組雌鼠妊娠結(jié)局的作用可能不明顯。HU會(huì)破壞培養(yǎng)的生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞之間正常的相互作用，而導(dǎo)致細(xì)胞脫落，這種脫落可能是HU誘導(dǎo)精子生成障礙、降低精子計(jì)數(shù)的一個(gè)原因；上述整體動(dòng)物

7、毒性試驗(yàn)結(jié)果，與體外毒性試驗(yàn)的預(yù)測(cè)、評(píng)估基本一致，說(shuō)明體外毒性試驗(yàn)結(jié)果，可以在一定程度上預(yù)測(cè)體內(nèi)毒性試驗(yàn)結(jié)果。但需要就HU對(duì)大鼠的一般生殖毒性機(jī)制作更為全面深入的研究和評(píng)價(jià)。 HU對(duì)大鼠的睪丸毒性及其作用機(jī)制：腹腔注射400mg／kgHU1或5d，分別在單次給藥后6、12和24h，以及連續(xù)給藥5d后D1或D10處死，取睪丸組織，光學(xué)顯微鏡下觀察，TUNEL、PAS染色顯示凋亡陽(yáng)性小管的百分?jǐn)?shù)和凋亡指數(shù)隨著HU劑量的增加而明顯增加

8、，12h時(shí)達(dá)蜂值，隨后減少；精原細(xì)胞和精母細(xì)胞特異性地受到影響；TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)階段特異性，主要存在于生精周期的I．Ⅳ階段；RT-PCR和Western印跡分析凋亡相關(guān)基因、蛋白產(chǎn)物，顯示HU處理后，Bax水平?jīng)]有出現(xiàn)明顯變化，但Bcl-2表達(dá)水平在HU處理后6或12h明顯降低；相反，F(xiàn)asL和Fas的表達(dá)水平在單次給藥12h開(kāi)始增加，并一直持續(xù)到連續(xù)給藥后的D16。上述結(jié)果表明，HU導(dǎo)致的大鼠睪丸生殖細(xì)胞的凋亡有細(xì)胞特異性和階段

9、特異性，這個(gè)過(guò)程涉及Bcl-2蛋白和Fas信號(hào)系統(tǒng)。 HU對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸毒性及其作用機(jī)制：雄性FasL轉(zhuǎn)基因型(TG)及野生型(WT)DBA／C57BL小鼠的(2×2)析因設(shè)計(jì)對(duì)比研究表明：TG小鼠生精小管的本底細(xì)胞凋亡水平增高，F(xiàn)as、FasLmRNA以及Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-9蛋白的本底表達(dá)水平也稍有增加。腹腔注射400／kgHU12h后，WT和TG小鼠睪丸生精小管形態(tài)無(wú)明顯變化，但曲細(xì)精

10、管細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，且TG小鼠較WT小鼠增加幅度更大。另外，雖然HU在TG及WT小鼠中均可誘發(fā)睪丸的DNA片段化和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Fas、FasLmRNA表達(dá)的上調(diào)；但與WT小鼠相比，TG小鼠的增加幅度更為明顯。Western印跡分析顯示，HU處理對(duì)WT和TG小鼠的凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表達(dá)無(wú)明顯影響，但可引起Fas、FasL、和Caspase-8等蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且TG小鼠的上調(diào)幅