HCMV PP65截短基因的原核表達(dá)及PP150原核表達(dá)條件的優(yōu)化.pdf

1、第一部分HCMV PP65 截短基因的原核表達(dá)及PP150原核表達(dá)條件的優(yōu)化 HCMV屬皰疹病毒β亞科，人類對(duì)其普遍易感。HCMV IgM陽性是近期感染標(biāo)志。免疫學(xué)方法檢測(cè)HCMV IgM是臨床上確診近期及復(fù)發(fā)感染最常用的方法。決定免疫學(xué)檢測(cè)方法的敏感性和特異性的關(guān)鍵試劑之一就是HCMV抗原。目前國(guó)內(nèi)試劑盒多采用全病毒抗原，該抗原成分復(fù)雜，易受非特異性因素(如混有成纖維細(xì)胞成分)的干擾，結(jié)果欠準(zhǔn)確。 基因工程抗原結(jié)構(gòu)單純

2、、性質(zhì)穩(wěn)定，可以提高免疫反應(yīng)的敏感性、特異性、穩(wěn)定性，易于標(biāo)準(zhǔn)化，生物安全性好。目前基因工程抗原已在逐漸代替全病毒抗原。但是，國(guó)內(nèi)基因工程抗原敏感性低，抗原性不穩(wěn)定，而進(jìn)口試劑價(jià)格昂貴，不利于檢測(cè)試劑盒的普及應(yīng)用。 HCMV被膜磷蛋白PP65是病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，編碼基因UL83全長(zhǎng)1686bp，561aa，有高度的保守性。PP65蛋白的297-510aa、372-445aa、401-426aa和513-539aa都有很高的親水性

3、，是抗原決定簇，可特異性的誘導(dǎo)IgM產(chǎn)生。 HCMV磷蛋白PPl50編碼基因UL32全長(zhǎng)3147bp，1048aa。PPl50蛋白的594-623aa、862-1048aa、1006-1048aa與IgM反應(yīng)最為特異，但敏感性較差，幾個(gè)肽段聯(lián)合表達(dá)時(shí)可提高反應(yīng)的敏感性。 用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)軟件預(yù)測(cè)HCMV PP65之321aa-562aa、PPl50之591aa-633aa和C末端1008-1046aa為具有較強(qiáng)抗原性、親

4、水性及與IgM特異性反應(yīng)的氨基酸序列。 本課題，設(shè)計(jì)用原核載體系統(tǒng)表達(dá)HCMV PP65之321aa-562aa、PPl50之59laa-633aa和C末端1008-1046aa，為EIASA、膠體金、免疫化學(xué)發(fā)光、蛋白芯片檢測(cè)提供抗原性強(qiáng)、敏感性好、特異性高的檢測(cè)試劑。 方法： 一．HCMV PP65截短基因的原核表達(dá) 1．PP65重組克隆載體pMDl 8-T-PP65的構(gòu)建： 根據(jù)PP65氨基

5、酸序列321aa-562aa相應(yīng)堿基序列961-1686bp(共726bp)設(shè)計(jì)引物，全病毒基因組作模板，PCR擴(kuò)增PP65片段，與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化TOP10菌株。 2．PP65重組表達(dá)載體pET30a(+)-PP65的構(gòu)建： 篩選含重組克隆載體的菌株擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DMD18-T-PP65，同時(shí)提取質(zhì)粒pEZ30a(+)，用Nde Ⅰ、XhoⅠ酶切，電泳后回收PP65及pET30a(+)片段，兩者進(jìn)行連接

6、后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。3．PP65工程蛋白的表達(dá)： 將含有重組表達(dá)載體pET30a(+)-PP65的菌體用誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 4．PP65表達(dá)產(chǎn)物的鑒定與蛋白純化： 用抗-HIS單克隆抗體作為一抗，羊抗人-HRP作為二抗進(jìn)行westernblot鑒定，用HIS-TAG蛋白純化柱進(jìn)行純化。 5．PP65蛋白抗原性的檢測(cè)： 與全病毒抗原比較、用ELISA方法對(duì)PP65抗原性、敏感性、特異

7、性進(jìn)行檢測(cè)。 二．HCMV PPl50原核表達(dá)條件的優(yōu)化 重組表達(dá)載體pET30a(+)-PP65，由本室構(gòu)建。鑒于表達(dá)量低，故設(shè)計(jì)如下優(yōu)化方案： 1．轉(zhuǎn)換表達(dá)系統(tǒng)(由pET30a(+)-PP150-BL21轉(zhuǎn)換為pBAD24-PP150-TOP10) 將保存菌液提取pET30a(+)-PP150質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。篩選陽性菌株，提取

8、質(zhì)粒pMD18-T-PP150，同時(shí)提取質(zhì)粒pBAD24，SmaI、HindⅢ酶切，瓊脂糖電泳后回收PPl50及pBAD24片段，兩者連接后轉(zhuǎn)化TOP10。將陽性菌株用LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，加入終濃度0.2％L-arab誘導(dǎo)表達(dá)。 2．轉(zhuǎn)換宿主菌表達(dá)(由BL21(DE3)轉(zhuǎn)換為BL21(DE3)plysS) 將本室保存重組表達(dá)載體系統(tǒng)pET30a(+)-PP150-BL21(DE3)提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plysS，

9、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用抗一HIS單克隆抗體作為一抗，羊抗人-HRP作為二抗進(jìn)行westemblot鑒定。與全病毒抗原比較、用ELISA方法對(duì)PP150抗原性、敏感性、特異性進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果： 一．HCMV PP65截短基因的原核表達(dá) PCR方法調(diào)取PP65目的基因片段，構(gòu)建重組克隆載體pMDl8-T-PP65及重組表達(dá)載體pET30a(+)-PP65。表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，35℃誘導(dǎo)4

10、h目的蛋白表達(dá)量約占總菌體蛋白的20％，純化后蛋白量占未純化蛋白量的10％。 二．HCMV PPl 50原核表達(dá)條件的優(yōu)化 1．轉(zhuǎn)換表達(dá)系統(tǒng)(由pET30a(+)-PP150-BL21轉(zhuǎn)換為pBAD24-PP150-TOP10) 構(gòu)建重組克隆載體pMD18-T-PP150及表達(dá)載體pBAD24-PP150。對(duì)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10后進(jìn)行0.2％L-arab誘導(dǎo)表達(dá)，35℃誘導(dǎo)4h目的蛋白表達(dá)量低于菌體蛋

11、白的7％。 2．轉(zhuǎn)換宿主菌表達(dá)(由BL21(DE3)轉(zhuǎn)換為BL21(DE3)plysS) 將重組表達(dá)載體pET30a，(+)-PP150轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)plysS，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，30℃誘導(dǎo)4h，PPl50目的蛋白表達(dá)量約占總菌體蛋白的20％。 三．抗原性檢測(cè) 初步ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，PP65抗原性、敏感性和特異性優(yōu)于全病毒抗原，PP150抗原性、敏感性及特異性弱于PP65。

12、 結(jié)論： 1．構(gòu)建PP65重組克隆載體pMD18-T-PP65和表達(dá)載體pET30a(+)-PP65，表達(dá)量占總菌體蛋白的20％，初步檢測(cè)其抗原性較強(qiáng)、敏感性及特異性高于全病毒蛋白。 2．構(gòu)建重組克隆載體pMD18-T-PP150和表達(dá)載體pBAD24-PP150，轉(zhuǎn)化TOP10菌體，表達(dá)量低于總菌體蛋白的7％。 重組表達(dá)載體pET30a(+)-PP150轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)plysS，表達(dá)量占總菌

13、體蛋白的20％，初步檢測(cè)其抗原性、敏感性及特異性弱于PP65。 第二部分 真菌提取物JN219抗病毒譜的初步研究 上世紀(jì)發(fā)現(xiàn)抗菌抗生素的發(fā)現(xiàn)，也為尋找抗病毒抗生素提供了研究途徑。本研究就是在獲得一株可產(chǎn)生抗病毒活性成分真菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了抗病毒譜的初步研究。 目的：探討真菌提取物JN219的體外抗病毒譜。 方法：采用體外細(xì)胞病變法，研究JN219對(duì)皰疹病毒科病毒(HCMV、HSV-1、HSV-2)、腺病毒

14、科病毒(Ad3)、副粘病毒科病毒(RSV)、呼腸病毒科病毒(RV SA11)、正粘病毒科病毒(流感甲地方株、流感乙地方株)、小RNA病毒科病毒(COX B1-6)、彈狀病毒科病毒(VSV)共15株病毒的抗病毒活性。將JN219與以上病毒作用1h后接種于相應(yīng)宿主細(xì)胞(同時(shí)設(shè)有病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照)，當(dāng)病毒對(duì)照病變達(dá)到90％以上時(shí)終止培養(yǎng)，宿主細(xì)胞用1％中性紅染色，在450nm讀取吸光度A值，．計(jì)算細(xì)胞存活率、半數(shù)中毒濃度(TD<,50>)、

15、半數(shù)有效濃度(IC<,50>)和抑毒指數(shù)(TI)。并根據(jù)TI判斷JN219的抗病毒活性，確定其抗病毒譜。 結(jié)果：JN219對(duì)HCMV、RV(SA11)、VSV有抑制作用，其IC50分別為1.42、0.96和1.22 μg/ml，T1分別為35.26、52.30、40.82；對(duì)HSV-1、HSV-2、RSV、流感病毒甲、流感病毒乙有部分抑制作用；對(duì)COX B1-6、腺病毒(Ad3)無作用。 結(jié)論：JN219抗病毒譜比較廣泛