囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)及重大疾病相關(guān)膜蛋白的純化方法與蛋白性質(zhì)研究.pdf

1、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和融合過程作為細(xì)胞生長繁殖的基本特征之一，在蛋白上膜及分泌途徑中發(fā)揮重要的功能。囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌在各個(gè)階段都需要一系列具有特殊功能的蛋白質(zhì)的參與。Munc13-1在細(xì)胞中囊泡的啟動(dòng)分泌階段發(fā)揮著重要作用。Exocyst復(fù)合物在囊泡的拴系和錨定過程中同樣不可或缺。目前，對此類蛋白的性質(zhì)和特征以及蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)的研究有利于我們深入了解它們在囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的分子作用機(jī)制。本文采用原核表達(dá)體系和層析技術(shù)表達(dá)純化了一系列具有結(jié)構(gòu)功能特

2、征的Munc13-1 缺失突變體，結(jié)合圓二色光譜，動(dòng)態(tài)光散射和分析超速離心等體外蛋白研究技術(shù)對各缺失突變體蛋白的性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和比較。Munc13-1 各缺失體蛋白的聚合狀態(tài)，顆粒均一性及蛋白穩(wěn)定性都存在著顯著的差異。根據(jù)圓二色光譜和分析超速離心實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們首次發(fā)現(xiàn)了Munc13-1蛋白在溶液中的長棒狀伸展螺旋束構(gòu)象結(jié)構(gòu)。結(jié)合同源建模構(gòu)建了Munc13-1蛋白在體內(nèi)以單體方式發(fā)揮功能的模型。Exocyst復(fù)合物的亞基蛋白Sec1

3、0的體外表達(dá)純化研究發(fā)現(xiàn)，Sec10蛋白本身作為一個(gè)相對折疊緊密的結(jié)構(gòu)來發(fā)揮功能，蛋白N 端或者C 端氨基酸的部分缺失都不可避免的導(dǎo)致了Sec10在表達(dá)過程中的錯(cuò)誤折疊，形成包涵體。電鏡分析發(fā)現(xiàn)了聚合的Sec10蛋白大部分以球形結(jié)構(gòu)存在。
　　 GABAB 受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體中的C蛋白家族，與各類神經(jīng)和精神錯(cuò)亂疾病有關(guān)。我們通過低溫表達(dá)和包涵體變性復(fù)性實(shí)驗(yàn)得到了可用于結(jié)晶的具有藥物結(jié)合靶點(diǎn)活性的胞外蛋白片斷。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G

4、LUT4 (Glucose Transporter 4)作為II型糖尿病領(lǐng)域研究中的關(guān)鍵蛋白，在維持體內(nèi)糖平衡起到重要作用。目前世界上還未有關(guān)于體外組織大規(guī)模純化GLUT4的相關(guān)報(bào)道。我們首次嘗試選用豬脂肪作為原材料，采用組織勻漿，差速離心和硫酸銨沉淀方法初步分離純化并獲得了足夠蛋白產(chǎn)量和純度的GLUT4。
　　 膜蛋白的純化與結(jié)晶是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域里的一大難題。當(dāng)前蛋白表達(dá)提取，蛋白性質(zhì)優(yōu)化等研究為進(jìn)一步的結(jié)晶學(xué)研究打下基礎(chǔ)