家蠶膜蛋白觸角結(jié)合蛋白(ABP)的純化及功能研究.pdf

1、靈敏的嗅覺對于昆蟲正常的成長發(fā)育、繁衍后代具有重要的作用，昆蟲的嗅覺系統(tǒng)是一個非常靈敏和專一性很強的化學(xué)監(jiān)測器，能從環(huán)境中成千上萬種不同氣味中識別出濃度低達幾百萬分之一的某些特殊氣味物質(zhì)。昆蟲能感受得到的環(huán)境中的氣味物質(zhì)絕大多數(shù)是脂溶性的小分子化合物，這些小分子化合物能夠通過觸角上皮細胞間的微小的孔道擴散到觸角感受器淋巴液，但是觸角感器的淋巴液是親水性的液體，外界環(huán)境中親脂性的氣味分子不能直接穿過這些親水性的淋巴液而到達嗅覺神經(jīng)樹突末梢

2、，這就需要氣味結(jié)合蛋白(odorantbindingproteins，OBPs)的幫助。
　　 觸角結(jié)合蛋白(antennalbindingprotein，ABP)是氣味結(jié)合蛋白的一個亞類，推測其在昆蟲嗅覺中起作用，但目前還沒有關(guān)于ABP三維結(jié)構(gòu)及其功能的詳細報道。本論文通過對ABP同源蛋白的分析、ABP的生物信息學(xué)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，推測ABP是鑲嵌在細胞內(nèi)膜的外周膜蛋白。ABP蛋白鑲嵌在細胞內(nèi)膜表面，當與氣味分子結(jié)合后通過構(gòu)

3、象改變脫離膜表面，溶解并攜帶氣味分子穿過親水性液體，運送到特定部位，同源蛋白分析及三級結(jié)構(gòu)及預(yù)測也顯示ABP結(jié)構(gòu)中含有親水與疏水性結(jié)構(gòu)，鑒于ABP的膜蛋白結(jié)構(gòu)特性，本論文通過添加去垢劑CHAPS分離純化天然膜蛋白觸角結(jié)合蛋白，又利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)純化融合表達的ABP蛋白，從這兩個方面研究對ABP進行探索試驗，為后續(xù)研究其結(jié)構(gòu)和功能提供了一個新的方法和工具。
　　 本文天然純化實驗材料是家蠶蠶蛹粉:原材料處理方法包括勻漿、差

4、速離心、密度梯度離心，然后利用高壓破碎和超速離心等方法手段獲得最初的膜組分，再經(jīng)離子交換層析進一步純化膜組份。使用兩性離子去垢劑CHAPS，所用儀器主要是AKTAexplorerl0蛋白純化儀，分離純化步驟包括陽離子交換層析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析并進行SDS-PAGE鑒定;初步獲得的蛋白樣品再經(jīng)過雙向電泳及質(zhì)譜分析鑒定，經(jīng)過肽段指紋圖譜分析，最終純化到天然的觸角結(jié)合蛋白。
　　 通過生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測得知，家蠶觸角結(jié)

5、合蛋白ORF含有423bp，編碼一個140個氨基酸殘基的單鏈多肽，蛋白相對分子量為15.5kDa，等電點為6.71，有一段由21個氨基酸殘基組成的信號肽和6段.螺旋，每個.螺旋上有一個半胱氨酸殘基并相互交叉形成3個二硫鍵，使得觸角結(jié)合蛋白形成一個口袋裝的三維結(jié)構(gòu)。通過家蠶蠶蛹提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板克隆ABP基因，設(shè)計引物時切去了信號肽部分的堿基構(gòu)建pET-32a-ABP（無SP）重組載體，成功誘導(dǎo)并大量表達融合目的蛋