藤黃酸聯(lián)合柔紅霉素對(duì)白血病耐藥細(xì)胞株(K562-A02)孕烷X受體表達(dá)的影響.pdf

1、研究目的:
　　(1)研究惡性血液病細(xì)胞株(K562/A02、K562、U266、RPMI-8226、HL60、Raji)孕烷X受體(Pregnane X receptor)的表達(dá)高低;
　　(2)探討藤黃酸(Gambogic acid, GA)對(duì)K562/A02耐藥細(xì)胞株的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　(1) Real-time PCR法檢測(cè)多個(gè)惡性血液病細(xì)胞株中PXR的表達(dá)
　　(2)采用

2、溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑(MTT)法檢測(cè)K562/A02細(xì)胞株分別與GA，DNR，GA+DNR孵育24 h、36h和48 h后細(xì)胞的增殖抑制率;
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、單加GA組、單加DNR組和GA+DNR組細(xì)胞的凋亡率;
　　(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組、單加DNR組和GA+DNR組細(xì)胞中DNR濃度;
　　(5) DAPI染色觀察對(duì)照組、單加GA組、單加DNR組和GA+DNR組

3、對(duì)K562/A02細(xì)胞形態(tài)的影響
　　(6)蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PXR蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1) Real-time PCR提示K562/A02細(xì)胞中PXR的表達(dá)水平為13.670±0.046，明顯高于其他各系細(xì)胞(K562:1.00±0.873，U266:7.205±0.459，RPMI-8226:2.828±0.928，HL60:1.364±0.038，Raji:0.

4、766±0.249)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2) GA聯(lián)合DNR作用于K562/A02耐藥細(xì)胞株24 h、36 h和48 h后，與單加DNR組相比細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素濃度明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯升高，提示GA可以逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞對(duì)DNR的耐藥。
　?、貲NR單藥作用于K562/A02耐藥細(xì)胞株48 h后測(cè)得DNR的IC50值為(26.48±0.98)μg/mL;
　?、诋?dāng)

5、GA濃度≤0.4μmol/L時(shí)，對(duì)K562/A02細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用，細(xì)胞抑制率在24 h、36 h和48 h均＜10％。
　　③將0.4μmol/L GA聯(lián)合不同濃度DNR作用于K562/A02細(xì)胞株48h后，所測(cè)得DNR的IC50值為(18.01±1.06)μg/mL;與DNR單藥組相比，細(xì)胞增殖抑制的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.47。
　?、蹹API染色結(jié)果顯示:單加DNR組可見(jiàn)部分細(xì)胞核

6、呈現(xiàn)凋亡特征，如染色質(zhì)濃縮;GA+DNR組細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)，產(chǎn)生凋亡小體。而單加GA組與對(duì)照組相比較，細(xì)胞的形態(tài)變化不明顯。
　?、萘魇郊?xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示GA聯(lián)合DNR與K562/A02細(xì)胞作用48 h后，其細(xì)胞內(nèi)DNR濃度較單用DNR組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　?、蘖魇郊?xì)胞儀術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞孵育48 h后的凋亡率，結(jié)果示DNR+GA組凋亡率較單用DNR組及單用GA組均升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

7、.05)。
　　(3)Real-time PCR提示:GA單藥組及GA+DNR組中PXR的表達(dá)水平分別為0.076±0.008和0.033±0.007，明顯低于對(duì)照組(1.00±0.183)和DNR組(3.099±0.874)，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組及單加柔紅霉素組表達(dá)差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(4)Western blot法結(jié)果示: GA+DNR組與GA組的PXR蛋白表達(dá)較對(duì)照組及DNR

8、組均顯著下調(diào)(P＜0.05)，但兩者間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，DNR組與對(duì)照組的PXR蛋白表達(dá)亦無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　(1) PXR可在多株惡性血液病細(xì)胞株中表達(dá)，其中在K562/A02細(xì)胞株中的表達(dá)較其他細(xì)胞高;
　　(2)小劑量的GA聯(lián)合DNR可以增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞抑制率，增加化療效果，其機(jī)制可能與下調(diào)PXR表達(dá)、增加細(xì)胞內(nèi)DNR藥物濃度、促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān);
　　(3)經(jīng)GA處