MyoD基因局部轉染心肌成纖維細胞用于心肌重建的實驗研究.pdf

1、第一部分MyoD基因重組腺病毒載體的構建 目的：構建MyoD基因重組腺病毒載體，為研究MyoD基因對心肌損傷的修復作用提供實驗基礎。 方法：從pEMSV-MyoD質粒上用PCR方法擴增出MyoDcDNA片段，并使MyoD基因加上CACC序列接頭，經過定向拓撲克隆使目的基因連接到轉移載體上，測序驗證后用LR酶促反應將目的基因轉移到腺病毒表達載體DNA上，獲得MyoD基因重組的腺病毒DNA，轉染HEK293A細胞，包裝、擴增

2、MyoD基因重組的腺病毒，測定病毒滴度，并對此病毒進行PCR鑒定。 結果：經PCR鑒定和DNA測序證實MyoD基因重組腺病毒含大小正確的目的片段，其DNA序列正確。病毒滴度為1.3-4.8×1011pfu/ml。 結論：成功構建了MyoD基因重組腺病毒載體。 第二部分MyoD基因誘導體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細胞向骨骼肌成肌細胞分化的實驗研究 第一節(jié)大鼠心室成纖維細胞的分離、培養(yǎng) 目的：探討大鼠心室成

3、纖維細胞分離、培養(yǎng)的方法。 方法：無菌條件下剪取SD大鼠乳鼠心室肌，采用胰酶消化的方法獲取心室肌細胞，差速貼壁法分離心室成纖維細胞，進行體外培養(yǎng)、擴增，觀察所培養(yǎng)細胞的形態(tài)，并用免疫細胞化學方法檢測波形蛋白、纖維連接蛋白和平滑肌肌動蛋白的表達。 結果：心室成纖維細胞在體外生長、增殖良好，生長迅速。剛分離出的心室成纖維細胞呈類圓形、三角形或多角形；24h-48h細胞體積增大，呈三角形、梭形或多角形；72h即呈融合狀態(tài)；消化

4、傳代后細胞生長速度加快，30min后開始貼壁，12h后貼壁完全，約2-3天即可傳代一次。免疫細胞化學檢測培養(yǎng)的心室成纖維細胞波形蛋白、纖維連接蛋白表達均為陽性，平滑肌肌動蛋白表達陰性。 結論：胰酶消化、差速貼壁法是一種合適的心室成纖維細胞的培養(yǎng)方法。 第二節(jié)MyoD基因誘導體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細胞向骨骼肌成肌細胞分化 目的：探討MyoD基因誘導體外培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細胞向成肌細胞分化的可能性。 方法：

5、SD大鼠乳鼠10只，采用胰酶消化、差速貼壁法分離、培養(yǎng)心室成纖維細胞，將培養(yǎng)的第3代心室成纖維細胞分為3組：對照組、LacZ基因組、MyoD基因組。將MyoD基因和LacZ基因重組腺病毒原液以2000pfu/cell的濃度分別轉染前1天接種的成纖維細胞，轉染時換無血清培養(yǎng)基，3h后洗去病毒，換完全培養(yǎng)基，40h后換成含2﹪胎牛血清的分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5天。相差顯微鏡及透射電鏡觀察對照組和誘導組細胞的形態(tài)；RT-PCR和Westernbl

6、ot方法檢測MyoD和肌細胞生成素(myogenin)的表達；免疫組化檢測骨骼肌肌球蛋白重鏈和結蛋白(desmin)的表達。 結果：對照組心肌成纖維細胞呈梭形、多角形、不規(guī)則形，胞體較大，細胞漿透明，粗面內質網豐富，未見肌絲結構；轉染MyoD基因重組腺病毒后，大鼠心肌成纖維細胞胞體伸展，逐漸變長，排列漸趨一致，7天后可見長梭形細胞平行排列走向，部分細胞融合形成肌管，胞漿內可見肌絲束；轉染LacZ基因重組腺病毒的細胞轉染前后形態(tài)無

7、變化，與對照組比較細胞形態(tài)無差別。RT-PCR可檢測出轉染MyoD基因后細胞表達MyoDmRNA；Westernblot結果表明轉染后細胞表達MyoD和myogenin；免疫組化檢測骨骼肌肌球蛋白重鏈和desmin表達均為陽性。 結論：MyoD基因可誘導體外培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細胞向骨骼肌成肌細胞分化，為進一步研究MyoD基因對心肌損傷的修復作用奠定了基礎。 第三部分MyoD基因局部轉染心肌成纖維細胞治療心肌梗死的實驗研

8、究第一節(jié)大鼠急性心肌梗死模型的建立 目的：探討建立大鼠急性心肌梗死模型的方法。 方法：30只SD大鼠隨機分為手術組和假手術組，每組各15只，麻醉后經鼻腔插管連接動物呼吸機，切開胸廓暴露心臟，結扎左冠狀動脈前降支，假手術組只穿線不結扎，手術中觀察心電圖的變化，4周后行心臟二維超聲心動圖檢查，并取心臟標本行病理檢查。 結果：手術組結扎冠狀動脈后，可見左室前壁逐漸由鮮紅轉變?yōu)榘底仙冶谂虺?；術后心電圖提示ST段明顯抬高

9、，呈一單向曲線；術后4周超聲檢查發(fā)現(xiàn)左心室前壁局部運動異常伴有室壁瘤形成；心臟大體標本可見左室前壁大面積灰白色心肌梗死區(qū)，局部心肌變薄，室壁塌陷形成室壁瘤。光鏡檢查提示假手術組心肌纖維規(guī)則排列，手術組梗死區(qū)心肌細胞胞漿凝固性壞死，纖維結締組織增生。 結論：開胸結扎冠狀動脈前降支是建立大鼠急性心肌梗死模型切實可行的方法。 第二節(jié)局部注射MyoD基因重組腺病毒修復心肌梗死后心肌損傷的實驗研究 目的：研究MyoD基因重

10、組腺病毒局部注入梗死區(qū)組織后對心肌損傷的修復作用。 方法：45只心肌梗死大鼠隨機分為MyoD基因組、LacZ基因組和對照組，每組15只，梗死1周后MyoD基因組在心肌梗死區(qū)注入100ul內含2×1010pfuMyoD基因重組腺病毒的無血清DMEM，LacZ基因組注入同樣劑量LacZ基因重組腺病毒，對照組予以等量無血清DMEM培養(yǎng)液接種，注射部位用黑絲線標記。干預治療后4周處死動物，獲取心臟標本，RT-PCR檢測梗死區(qū)組織MyoD

11、mRNA的表達；送光鏡及電鏡檢查；免疫組化測定梗死區(qū)組織骨骼肌肌球蛋白重鏈和cTnI的表達；切片后1﹪TTC染色，測定梗死厚度、梗死面積，并計算其占左心室面積的百分比。 結果：MyoD基因轉染后在心肌梗死部位用RT-PCR方法檢測到MyoDmRNA的表達，而LacZ基因組和對照組無MyoDmRNA的表達；HE染色光鏡檢查顯示LacZ基因組和對照組梗死區(qū)鏡下見纖維結締組織增生，梗死區(qū)內無肌肉組織，MyoD基因組梗死區(qū)內見多處條索狀

12、、孤島狀不一的新生肌肉組織，其周圍血管豐富；透射電鏡LacZ基因組和對照組梗死區(qū)見纖維細胞，MyoD基因組梗死區(qū)內見新生的帶橫紋的肌細胞，明暗帶清晰，未見閏盤結構；免疫組化顯示MyoD基因組梗死區(qū)內的肌肉組織骨骼肌肌球蛋白重鏈陽性，而cTnI陰性；TTC染色心肌存活區(qū)呈紅色，梗死區(qū)不著色，三組心臟左心室面積無顯著差異(P＞0.05)，MyoD基因組梗死厚度、梗死區(qū)面積及其占左心室面積的百分比明顯小于對照組和LacZ基因組(P＜0.01)

13、。 結論：MyoD基因重組腺病毒注入心肌梗死部位可以誘導骨骼肌樣細胞分化，修復心肌損傷。 第三節(jié)局部注射MyoD基因重組腺病毒對心肌梗死后心功能的影響 目的：研究MyoD基因重組腺病毒局部注入梗死區(qū)組織后對心功能的影響。 方法：50只SD大鼠以開胸結扎冠狀動脈前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，成功45只，隨機分為對照組、LacZ基因組和MyoD基因組，每組15只，心梗后1周MyoD基因組在心肌梗死區(qū)注