載玻片原位培養(yǎng)羊水細(xì)胞技術(shù)的建立和臨床應(yīng)用研究.pdf

1、背景:
　　羊水細(xì)胞培養(yǎng)及核型分析是產(chǎn)前診斷的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)需要?dú)v經(jīng)羊水細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片、顯微鏡下拍取核型以及核型分析等諸多步驟，以完成最終的臨床報(bào)告。隨著產(chǎn)前篩查不斷普及和產(chǎn)前診斷需求量急速增加的狀況，傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞培養(yǎng)（耗時(shí)、耗力）無(wú)法滿足臨床需求，且傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞培養(yǎng)步驟繁多，不宜于產(chǎn)前診斷質(zhì)量控制。為了縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高工作效率，研究人員不斷探索，改進(jìn)培養(yǎng)方法，優(yōu)化流程，其中最成功的是研制自動(dòng)核型掃描儀，即將顯微鏡與

2、自動(dòng)進(jìn)片的軌道相連接，以實(shí)現(xiàn)24小時(shí)無(wú)人值守全自動(dòng)換片、取片、掃描、滴油、采集核型。該自動(dòng)核型掃描儀在外周血培養(yǎng)核型捕獲中顯示快速、省力的極好效果，但不能移植到羊水染色體核型捕獲中，問(wèn)題在于羊水原位培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁于25×25cm的塑料培養(yǎng)瓶，塑料瓶底片不平整、厚度太高，顯微鏡無(wú)法自動(dòng)調(diào)節(jié)焦距自動(dòng)掃描捕獲。羊水細(xì)胞培養(yǎng)要實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化閱片，首要問(wèn)題是解決細(xì)胞在載玻片上原位培養(yǎng)。如何實(shí)現(xiàn)羊水活性細(xì)胞在載玻片上貼壁、原位收獲、分散、消化染色，達(dá)到

3、標(biāo)準(zhǔn)條帶，是非常難以克服的技術(shù)，其涉及染色體分散動(dòng)力學(xué)、表面張力、培養(yǎng)性能等多方面因素。
　　目的:
　　本研究以載玻片為培養(yǎng)載體，以3-氨丙基-3-甲氧基硅烷(3-Aminopropyl-Triethoxysilane，APES)為細(xì)胞黏附劑，自制載玻片培養(yǎng)瓶。探索載玻片上染色體核型分散的影響因素，染色體分散的質(zhì)量評(píng)估體系，建立載玻片原位培養(yǎng)羊水細(xì)胞技術(shù)規(guī)范化流程。通過(guò)100例臨床羊水標(biāo)本與常規(guī)塑料瓶原位培養(yǎng)技術(shù)同步比對(duì)研

4、究，實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。
　　方法:
　　1.載玻片清潔處理后，經(jīng)APES∶丙酮稀釋比例、浸泡時(shí)間，丙酮洗滌次數(shù)（設(shè)計(jì)了三因素三水平正交試驗(yàn)），晾干，環(huán)氧乙烷消毒包裝。取27例羊水標(biāo)本，采用不同處理方法的載玻片進(jìn)行原位培養(yǎng)羊水細(xì)胞，通過(guò)評(píng)估細(xì)胞貼壁能力，篩選較佳的載玻片處理?xiàng)l件。
　　2.自制載玻片與進(jìn)口原裝載玻片培養(yǎng)瓶同步培養(yǎng)10例羊水，分析細(xì)胞克隆數(shù)與有效分裂相數(shù)，比對(duì)兩種載玻片貼壁能力。
　　3.取40例羊水標(biāo)本

5、用自制載玻片培養(yǎng)，探索不同溫度、濕度組合下染色體分散質(zhì)量，分析羊水有核細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞克隆數(shù)，細(xì)胞克隆數(shù)與有效分裂相數(shù)相關(guān)性。建立載玻片原位培養(yǎng)羊水細(xì)胞技術(shù)規(guī)范化流程。
　　4.隨機(jī)選擇產(chǎn)前診斷患者100例，用自制載玻片法原位培養(yǎng)和塑料瓶培養(yǎng)法同步培養(yǎng)羊水細(xì)胞，進(jìn)行臨床檢測(cè)比對(duì)試驗(yàn)，比對(duì)兩種方法細(xì)胞貼壁成功率、細(xì)胞克隆數(shù)目、有效分裂相數(shù)及核型符合率，評(píng)價(jià)臨床應(yīng)用可行性。
　　結(jié)果:
　　1.自制原位培養(yǎng)的載玻片較佳制作工藝

6、為APES∶丙酮稀釋比例1∶25，處理10min，丙酮沖洗1次。
　　2.自制載玻片上細(xì)胞克隆數(shù)的平均值為34.5±2.64，有效分裂相數(shù)平均值為15.8±1.14;進(jìn)口Euroclone載玻片上細(xì)胞克隆數(shù)的平均值為37.6±6.11，有效分裂相數(shù)平均值為16.0±1.05。配對(duì)t檢驗(yàn)分析經(jīng)不同載玻片種類(lèi)培養(yǎng)的細(xì)胞克隆數(shù)和有效分裂相數(shù)，細(xì)胞克隆數(shù)P=0.128(P＞0.05)，有效分裂相數(shù)P=0.555(P＞0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差

7、異。自制載玻片獲得細(xì)胞克隆數(shù)和有效分裂相數(shù)能力不亞于進(jìn)口載玻片，且價(jià)格低。
　　3.溫度(Temperature，T)、濕度（Humidity，H）綜合影響染色體分散質(zhì)量，以T=21，H=50;T=22，H=48;T=23，H=46; T=24，H=44組合，干燥時(shí)間200～300s為佳，可獲得60％～65％的有效中期分裂相用于染色體核型分析。Pearson分析胎兒有核細(xì)胞數(shù)與貼壁克隆數(shù)相關(guān)性，R=0.344。貼壁克隆數(shù)在≤40個(gè)

8、范圍內(nèi)與有效分裂相成正相關(guān)，克隆數(shù)＞40有效分裂相減少。
　　4.自制載玻片與塑料瓶原位培養(yǎng)法比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩者培養(yǎng)成功率均為100％。采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，兩個(gè)方法的細(xì)胞克隆數(shù)無(wú)顯著差異(P=0.497)，有效分裂相數(shù)無(wú)顯著差異(P=0.759)。100例羊水經(jīng)兩種方法同步培養(yǎng)，核型符合率達(dá)100％，檢出正常核型95例，異常核型5例，染色體多態(tài)性改變3例，18三體1例，mos47，XX，+7[3]/46，XX[17]1例，自制