異種脫蛋白松質(zhì)骨為載體構(gòu)建組織工程骨髓柱橫突間融合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的；(1)探討異種脫蛋白松質(zhì)骨理化與機(jī)械性能。(2)異種脫蛋白松質(zhì)骨載體與自體MSCs的相容性以及對(duì)其生物學(xué)行為的影響。(3)探討異種脫蛋白松質(zhì)骨植入體內(nèi)的免疫情況。(4)異種脫蛋白松質(zhì)骨為載體構(gòu)建組織工程骨在山羊脊柱橫突間成骨融合觀察。 方法；(1)取成年豬股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)部分，制為3cm×0.5cm×0.5cm大小骨條，其長(zhǎng)軸與所取松質(zhì)骨骨小梁排列方向一致，取材各骨塊的表觀孔隙密度基本相同。骨塊1∶1氯仿甲醇液脫脂24小時(shí)，5

2、0℃蒸餾水震蕩沖洗，20％H2O2浸漬24小時(shí)。反復(fù)3次。將處理后的骨塊蒸餾水于室溫下浸泡透析24小時(shí)，烘干。檢測(cè)內(nèi)容：處理液中羥脯氨酸的含量；掃描電鏡觀察大體形態(tài)結(jié)構(gòu)；組織學(xué)觀察；X線衍射分析無(wú)機(jī)成分的組成和晶體結(jié)構(gòu)；氨基酸分析；生物力學(xué)性能研究。(2)抽取山羊髂骨骨髓5ml，梯度密度離心法分離提純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，于含10％胎牛血清的DMEM液培養(yǎng)；細(xì)胞匯合至90％生長(zhǎng)面積時(shí)消化傳代，傳至第二代時(shí)換含1×10-7mol/L地塞米松、

3、1×10-2mol/Lβ-甘油磷酸鈉、100mg/L維生素C的培養(yǎng)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)；誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞通過(guò)堿性磷酸酶染色進(jìn)行鑒定。消化后計(jì)數(shù)，以2×106個(gè)/ml密度的MSCs細(xì)胞懸液復(fù)合載體材料培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼附及基質(zhì)分泌情況，檢測(cè)ALP活性，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、DNA倍體水平及細(xì)胞凋亡率。相同數(shù)量MSCs單純培養(yǎng)板培養(yǎng)為對(duì)照組。(3)8只6-8月齡雄性青山羊，隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組橫突間植入異種脫蛋白松質(zhì)骨，對(duì)照組為新

4、鮮松質(zhì)骨，術(shù)前24小時(shí)及術(shù)后3天、7天、14天、28天抽取外周血，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+和CD28+水平；術(shù)后28天取出植入材料，采用免疫組化方法檢測(cè)抗原情況。(4)24只6-8月齡雄性青山羊，隨機(jī)分為兩組，制作脊柱3-4腰椎橫突間植骨模型，采用Luque棒作內(nèi)固定。實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同植入物分為A、B、C、D四組。A組：異種脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合一定數(shù)量的自體MSCs和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(組織工程骨)；B組：異種脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合骨形

5、態(tài)發(fā)生蛋白(BMP復(fù)合骨)；C組：自體髂骨；D組：?jiǎn)渭儺惙N脫蛋白松質(zhì)骨。4、8、12周取材，X線、組織學(xué)和力學(xué)強(qiáng)度測(cè)定。 結(jié)果；(1)經(jīng)脫蛋白處理的松質(zhì)骨立體空間結(jié)構(gòu)并無(wú)大的破壞，由羥基磷灰石和膠原網(wǎng)架構(gòu)成大小不等、相互交通、開放的孔隙和高度的孔隙間連接。保存了原骨的骨小梁、小梁間隙和骨內(nèi)管腔系統(tǒng)，它的孔徑200-500μm，孔隙率可達(dá)70％以上。處理液中羥脯氨酸含量為0.06％。材料中膠原類氨基酸與新鮮松質(zhì)骨無(wú)明顯差異，而芳香

6、族氨基酸如酪氨酸、蛋氨酸波峰消失。脫蛋白松質(zhì)骨抗壓強(qiáng)度與新鮮松質(zhì)骨塊無(wú)顯著差異(p＞0.05)，彈性模量增加(p＜0.05)。(2)MSCs經(jīng)分離提純后在10％胎牛血清DMEM液生長(zhǎng)良好，12-14天后鋪滿瓶底，傳代倍增時(shí)間為33.6小時(shí)，達(dá)到細(xì)胞傳代的要求。誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞行ALP染色，染色結(jié)果提示誘導(dǎo)后得到的細(xì)胞符合成骨細(xì)胞的特點(diǎn)，陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)圖像分析軟件計(jì)算而得的百分率為90％以上。接種于載體上的MSCs在復(fù)合后3天在孔隙內(nèi)表面貼

7、壁生長(zhǎng)，并分泌較多的細(xì)胞外基質(zhì)，復(fù)合后5天，細(xì)胞基質(zhì)分泌旺盛，幾乎充滿支架孔隙。顯示了良好的組織相容性。復(fù)合后7天，見基質(zhì)分泌依然旺盛，但較第5天差別不大。與對(duì)照組相比，ALP活性無(wú)顯著差異。兩組細(xì)胞周期大致相同，未見異倍體細(xì)胞。(3)術(shù)前24小時(shí)實(shí)驗(yàn)組外周血T細(xì)胞亞群表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與術(shù)前相比差異不顯著(P＞0.05)，CD3+、CD4+、CD8+、CD28+曲線變化同步，體內(nèi)植入4周材料免疫酶染色未見陽(yáng)性區(qū)

8、域。對(duì)照組術(shù)后3天T細(xì)胞亞群開始增高，第7天CD3+、CD4+、CD28+達(dá)高峰，14天開始下降，CD8+第28天依然維持在較高水平。CD3+、CD4+、CD8+、CD28+曲線變化不完全同步，各時(shí)間點(diǎn)均高于異種脫蛋白松質(zhì)骨組(P＜0.05)，體內(nèi)植入4周材料免疫組化染色可見陽(yáng)性區(qū)域。(4)各組材料脊柱橫突間融合情況：放射學(xué)評(píng)估：術(shù)后4周開始A、B、C三組均有新骨生成，且成骨量隨時(shí)間推移而增加。D組成骨差，隨時(shí)間推移大部材料吸收，僅橋接

9、宿主骨床部有少量骨痂生成。組織學(xué)評(píng)估，術(shù)后4周所有植入材料均有少量淋巴細(xì)胞侵入，但8、12周消失。A組以多點(diǎn)方式形成新骨，第4周Brdu免疫組化染色仍可見陽(yáng)性細(xì)胞，成骨能力好于B組，接近C組。B組新生骨呈明顯梯度生長(zhǎng)，靠近骨床部成骨活躍，逐漸向中央生長(zhǎng)。各組骨融合段折彎試驗(yàn)依次為C組＞A組＞B組＞D組。 結(jié)論；(1)異種脫蛋白松質(zhì)骨具有良好的孔隙與孔隙率，低免疫原情況下可以保持良好的力學(xué)性能。(2)與自體MSCs有良好的細(xì)胞相容