共抑制分子Z39Ig在HBV慢性感染中的作用及其免疫調(diào)節(jié)功能在肝臟免疫耐受形成中的作用研究.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)最大的消化腺,負(fù)責(zé)對從食物中分解得到的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行攝取、代謝、解毒和貯存。此外,肝臟也是一個特殊的免疫器官,負(fù)責(zé)清除自胃腸道進(jìn)入機體的病原微生物和一些自身代謝組分。這些抗原物質(zhì)通過肝臟內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞的加工處理被實時遞呈給肝臟內(nèi)循環(huán)的T細(xì)胞。肝臟局部發(fā)生的T細(xì)胞免疫應(yīng)答受到精細(xì)的調(diào)控,從而決定某一抗原進(jìn)入肝臟的命運:引起免疫應(yīng)答或者維持免疫耐受。生理條件下,T細(xì)胞功能正常,維持肝臟局部乃至全身免疫平衡。病理條件下,T細(xì)胞對自身

2、抗原產(chǎn)生應(yīng)答則會導(dǎo)致自身免疫性肝病的發(fā)生,若對外來抗原不能有效應(yīng)答則會導(dǎo)致慢性感染或者腫瘤的發(fā)生。
　　 肝臟是容易發(fā)生免疫耐受的器官。迄今為止,肝移植是最容易存活的器官移植。臨床上很早就觀察到甚至在不用任何免疫抑制劑進(jìn)行預(yù)處理時,移植肝臟仍可存活,而不發(fā)生移植排斥反應(yīng),并且可以用和肝臟聯(lián)合移植的辦法提高其他移植器官的存活率,如肝腎聯(lián)合移植。然而,肝臟易發(fā)生免疫耐受的特性是把雙刃劍,一些病毒如HBV和HCV感染,以及寄生蟲如血吸

3、蟲感染時,肝臟內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞常發(fā)生免疫耐受,這使得感染常常轉(zhuǎn)為慢性且遷延不愈,最終導(dǎo)致肝臟發(fā)生嚴(yán)重的病理改變。
　　 T細(xì)胞的分化、活化及發(fā)揮效應(yīng)需要雙信號的作用,即來自TCR的第一信號和來自共刺激分子的輔助調(diào)節(jié)信號。越來越多的研究表明,共刺激信號在調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答方向中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,合理地封閉或增強共刺激途徑已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤、病毒和寄生蟲感染、移植排斥等領(lǐng)域的實驗治療研究中。共刺激分子可分為兩大類,一類可誘導(dǎo)并增強T細(xì)胞

4、對抗原的免疫應(yīng)答,如B7.1和B7.2,另一類則可誘導(dǎo)T細(xì)胞對抗原產(chǎn)生耐受,抑制T細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng),又稱為共抑制分子,如B7-H1和B7-DC等。其中,共抑制分子在誘導(dǎo)肝臟免疫耐受中發(fā)揮的作用是近年來關(guān)注的熱點。
　　 Z39Ig是新近鑒定的對T細(xì)胞活化及存活有重要調(diào)節(jié)作用的B7家族相關(guān)分子,主要表達(dá)于部分組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞表面,特別是肝臟的Kupffer細(xì)胞表面,外周血細(xì)胞中表達(dá)缺如。研究表明,Z39Ig可交聯(lián)尚未知的受體分子抑制T

5、細(xì)胞活化和增殖,且對T細(xì)胞的抑制功能強于PD-Ls/PD-1通路。動物實驗發(fā)現(xiàn),Z39Ig可顯著降低抗原特性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的能力,提示Z39Ig在誘導(dǎo)外周耐受中發(fā)揮作用。那么,Z39Ig是否在維持肝臟免疫耐受中發(fā)揮作用呢?
　　 本研究首先分析了Z39Ig在HBV慢性感染中的作用。我們收集了39例慢性HBV感染患者的肝穿樣本,通過免疫熒光雙重染色發(fā)現(xiàn)Z39Ig定位于慢性HBV感染患者肝組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞表面,而無

6、異位表達(dá)。進(jìn)一步利用免疫組織化學(xué)染色比較了HBV患者肝穿組織和正常肝組織內(nèi)Z39Ig的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)與其它共抑制分子不同的是,Z39Ig的表達(dá)在患者而言是降低的,特別是在炎癥更為明顯的免疫活性病人。進(jìn)而分析了Z39Ig的表達(dá)與免疫活性病人臨床參數(shù)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)Z39Ig的表達(dá)與患者血清病毒載量呈正相關(guān),而與血清ALT的水平呈負(fù)相關(guān),說明Z39Ig可能參與了HBV慢性化的病理進(jìn)程且其表達(dá)受炎癥因子的調(diào)控。為了證實巨噬細(xì)胞表達(dá)Z39Ig的確

7、有抑制T細(xì)胞的作用,我們構(gòu)建了表達(dá)Z39Ig的慢病毒載體,包裝獲得病毒上清后將其感染293FT細(xì)胞,之后與CD4+及CD8+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),檢測T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌能力,結(jié)果顯示膜結(jié)合型Z39Ig可顯著降低T細(xì)胞的增殖能力和IL-2及IFN-γ的分泌水平,說明Z39Ig確實可抑制T細(xì)胞應(yīng)答。我們進(jìn)一步探討了引起Z39Ig表達(dá)下調(diào)的可能因素,體外實驗發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子均能下調(diào)Z39Ig的表達(dá),但以IFN-γ最為明顯,并且可以時間和劑量

8、依賴的方式下調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)Z39Ig。我們用定量PCR的方法檢測了免疫活性患者肝組織內(nèi)IFN-γ和Z39Ig的表達(dá),結(jié)果提示二者呈顯著負(fù)相關(guān)。體外細(xì)胞因子阻斷實驗提示活化T細(xì)胞來源的IFN-γ可下調(diào)巨噬細(xì)胞表面Z39Ig的表達(dá)。本部分實驗結(jié)果提示肝臟巨噬細(xì)胞表達(dá)的Z39Ig(主要是Kupffer細(xì)胞)參與了HBV慢性感染的病理進(jìn)程,同時,肝臟內(nèi)的T細(xì)胞也存在反饋調(diào)節(jié)機制--下調(diào)共抑制分子的表達(dá)以維持自己的抗病毒功能。
　　 為了

9、明確Z39Ig分子參與肝臟免疫耐受的可能機制,我們比較了Z39Ig基因敲除小鼠和野生型小鼠肝臟內(nèi)T淋巴細(xì)胞的分布和表型,結(jié)果提示Z39Ig的表達(dá)并不影響肝臟內(nèi)T細(xì)胞上述指標(biāo)。接下來我們建立了ConA誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎模型,比較了Z39Ig的表達(dá)對急性炎癥的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論是血清轉(zhuǎn)氨酶水平還是肝臟病理損傷程度,Z39Ig基因敲除小鼠和野生型小鼠均無顯著區(qū)別,進(jìn)一步分析了肝臟局部T細(xì)胞的活性和T細(xì)胞亞群的比例,結(jié)果也提示無顯著差異

10、。說明Z39Ig表達(dá)與否對肝臟急性炎癥時的免疫狀態(tài)無顯著影響。我們進(jìn)一步建立了ConA誘導(dǎo)的肝臟免疫耐受模型,同樣比較了當(dāng)再次接受ConA刺激后肝臟的病理損傷程度和血清轉(zhuǎn)氨酶的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型小鼠肝臟僅見淋巴細(xì)胞浸潤,血清轉(zhuǎn)氨酶輕度升高,呈現(xiàn)為免疫耐受狀態(tài),而Z39Ig基因敲除小鼠的肝臟則可見局部壞死,且血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高,與野生型小鼠相比有顯著差異。檢測肝臟局部T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力則發(fā)現(xiàn)Z39Ig基因缺失小鼠肝臟CD4+T細(xì)

11、胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的能力明顯增高,細(xì)胞因子定量檢測結(jié)果也佐證了這一發(fā)現(xiàn)。此部分結(jié)果說明Z39Ig在維持肝臟免疫耐受中發(fā)揮一定作用,特別是可能在慢性炎癥中起作用。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞特異表達(dá)的共抑制分子Z39Ig在誘導(dǎo)肝臟免疫耐受中發(fā)揮一定作用,可能是導(dǎo)致HBV感染慢性化的機制之一。明確Z39Ig信號的精確調(diào)控機制可能為理解肝臟免疫耐受的特性提供新的思路和線索,也為臨床治療肝臟相關(guān)疾病提供了一定的理論依據(jù)