中國野生毛葡萄VqRSGT基因的遺傳轉(zhuǎn)化與功能研究.pdf

1、葡萄是世界四大果樹之一，在世界范圍內(nèi)有著廣泛的栽培與種植，目前主栽的釀酒及鮮食品種主要為歐洲葡萄（Vitis vinifera.L），其品質(zhì)優(yōu)良，但大多數(shù)抗病性較差，尤其不抗白粉病。白藜蘆醇作為一種植保素，參與調(diào)控葡萄響應白粉菌侵染的過程并發(fā)揮抗病效用，因此研究白藜蘆醇代謝相關基因的功能將有助于更深入了解葡萄的抗病機理。中國是葡萄起源中心之一，具有豐富的野生葡萄資源和抗病葡萄品種，前期研究表明中國野生毛葡萄丹鳳-2（Vitis.quin

2、quangularis Rehd.Dangfeng-2）的白藜蘆醇含量較高，且對白粉病有著較強抗性。本研究以中國野生毛葡萄丹鳳-2為材料，通過同源克隆獲得白藜蘆醇糖基轉(zhuǎn)移酶基因編碼區(qū)序列，構(gòu)建植物過表達載體，利用農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化歐洲葡萄無核白和紅地球，對基因表達特性及轉(zhuǎn)基因葡萄對白粉菌的響應進行了研究，取得主要結(jié)果如下:
　　1.比較了4種歐洲葡萄霞多麗（V.vinifera cv.Chardonnay）、黑比諾(V.vini

3、fera cv.Pinot Noir)、赤霞珠（V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon）和紅地球(V.vinifera cv.Red Globe)的3種外植體（雄蕊、子房和小花蕾）在3種誘導培養(yǎng)基（PIV、MS1和PN）上胚性愈傷組織的誘導率。結(jié)果表明最適合胚性愈傷組織誘導的外植體為花粉小孢子處于單核靠邊期的小花蕾，總體上MS1和PIV的誘導效率較好。針對不同基因型的葡萄，其適合的誘導培養(yǎng)基成分也不相同，PIV

4、培養(yǎng)基更適合霞多麗和黑比諾胚性愈傷組織的誘導;MS1培養(yǎng)基更適合赤霞珠胚性愈傷組織的誘導;PN培養(yǎng)基更適合紅地球胚性愈傷組織的誘導。
　　2.比較了3種歐洲葡萄無核白（V.vinifera cv.Thompson Seedless）、紅地球和赤霞珠以單芽莖段為外植體在3組培養(yǎng)基上的器官發(fā)生誘導不定芽的再生。以激素組合分別為1.0mg/L BAP、1.0mg/L BAP+0.02mg/L NAA、2.0mg/L BAP+0.02mg

5、/L NAA和4.0mg/L BAP+0.02mg/L NAA的系列培養(yǎng)基，相較于添加0.1mg/L2，4-D或0.1mg/L TDZ的系列培養(yǎng)基更適合無核白、紅地球和赤霞珠葡萄單芽莖段逐步誘導出分生愈傷組織。
　　3.優(yōu)化了無核白葡萄愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化體系，確立了重懸液pH5.1，菌液濃度OD6001.0，真空滲透20min條件下，轉(zhuǎn)化效率最優(yōu)。利用優(yōu)化的瞬時轉(zhuǎn)化體系瞬時轉(zhuǎn)化無核白葡萄的愈傷組織、莖、根、卷須、幼葉、成齡葉和老葉，

6、發(fā)現(xiàn)在不同器官中轉(zhuǎn)化效率存在顯著差異，其中以愈傷組織為受體的轉(zhuǎn)化效率顯著高于其他器官（GUS酶活力為65231.99±3339.29pmol/min/mg），而且愈傷組織的GUS組織化學染色最深，以葉片為受體的轉(zhuǎn)化效率則最低。
　　4.同源克隆獲得中國野生毛葡萄白藜蘆醇糖基轉(zhuǎn)移酶VqRSGT的開放閱讀框序列，經(jīng)預測其定位于葡萄第三號染色體，CDS為1440bp，編碼479個氨基酸，與歐洲葡萄黑比諾的VvRSGT氨基酸序列對比僅有一

7、個氨基酸的不同。亞細胞定位結(jié)果表明VqRSGT定位在細胞質(zhì)及細胞核中。
　　5.通過PCR及Western Bloot檢測確定獲得4個株系的轉(zhuǎn)VqRSGT基因的無核白葡萄和3個株系的轉(zhuǎn)VqRSGT基因的紅地球葡萄。RT-PCR結(jié)果顯示外源VqRSGT的表達不同程度的提高了苯丙氨酸代謝途徑中其上游的相關基因的表達量;對野生型及轉(zhuǎn)基因株系進行壓片法接種白粉菌24，48，72和168h后，統(tǒng)計野生型和轉(zhuǎn)基因株系葉片上孢子數(shù)及菌絲數(shù)，其數(shù)