β-,1-腎上腺素受體細(xì)胞胞外第二環(huán)自身抗體對(duì)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣的增強(qiáng)作用.pdf

1、研究背景:
　　 近年來的研究表明，β1腎上腺素能受體(β1-adrenoceptor，β1-AR)細(xì)胞外第二環(huán)(thesecond extracellular loop ofβ1-adrenoceptor，β1-AR-ECⅡ)自身抗體及其自身免疫機(jī)制可能參與了原發(fā)型擴(kuò)張性心肌病、風(fēng)濕型性臟病、Chagasic病、原發(fā)性心電紊亂病等多種心臟疾病的發(fā)病過程。β1腎上腺素能受體細(xì)胞外第二環(huán)自身抗體(autoantibodies ag

2、ainst the secondextracellular loop ofβ1-adrenoceptor，β1-AA)在心臟病發(fā)生、發(fā)展中的病理生理作用日益受到研究者的關(guān)注。之前的研究均是通過采用與人β1-AR-ECⅡ表位肽段序列相一致的合成肽段免疫動(dòng)物得到的結(jié)果，這種主動(dòng)免疫模型有兩個(gè)主要的不足：其一，由于該模型是用抗原誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，所以無法控制動(dòng)物體內(nèi)相應(yīng)抗體(即β1-AA)的水平，結(jié)果導(dǎo)致動(dòng)物模型血清中β1-AA的水平

3、遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨床病人血清中的實(shí)際值：其二，用該模型得出的研究結(jié)果不能排除抗原肽段對(duì)機(jī)體的損傷作用。因此，完善現(xiàn)有的動(dòng)物模型以更好地模擬臨床，成為研究β1-AA在心功能不全等疾病中病理生理學(xué)意義的基礎(chǔ)。
　　 對(duì)β1-AA的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該自身抗體具有類β-AR激動(dòng)劑樣的作用，可以導(dǎo)致急性分離的正常動(dòng)物心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平增加。然而，β1-AA長期存在是否會(huì)影響心肌細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+水平尚不清楚，而后者是臨床上能否將Ca2+作為β

4、1-AA導(dǎo)致心功能不全治療的靶點(diǎn)。
　　 研究目的:
　　 1.建立并完善β1-AA被動(dòng)免疫大鼠模型，使動(dòng)物模型血清中β1-AA水平與臨床心功能不全患者血清中β1-AA水平相匹配。
　　 2.利用上述模型觀察β1-AA長期存在對(duì)大鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣水平的影響及作用途徑。
　　 材料和方法:
　　 1.抗人β1腎上腺素能受體自身抗體(β1-AA)的制備
　　 1.1抗人β1-AR抗原肽段的

5、合成：按照人β1-AR-ECⅡ的功能表位肽段(197～223，H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A，人鼠同源性100％，由吉爾生化上海有限公司合成，純度大于95％)。合成的肽段儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆?，用于后續(xù)血清抗體的定性、定量和血清抗體的功能測(cè)定。
　　 1.2β1-AA抗體制備：使用上述抗原肽段對(duì)Wistar大鼠(8周齡，體重160～180g，n=20)進(jìn)行為

6、期8周的主動(dòng)免疫，制備β1-AA血清，其效價(jià)用SA-ELISA(Streptavidin-enzyme linked immunosorbent assay)方法檢測(cè)。利用MAb Trap Kit試劑盒對(duì)血清中的β1-AA進(jìn)行提取和純化。純化后的抗體蛋白液先經(jīng)PAGE凝膠電泳檢測(cè)其純度，然后使用BCA試劑盒對(duì)提取液進(jìn)行蛋白定量。
　　 2.被動(dòng)免疫大鼠模型的建立
　　 2.1被動(dòng)免疫方案：按照預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將純化的β1-

7、AA以0.7μg/g的劑量通過尾靜脈注入正常大鼠體內(nèi)，每2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫40周。對(duì)照組以0.7μg/g的劑量通過尾靜脈注入陰性IgG，免疫程序和檢測(cè)方法同上。
　　 2.2大鼠心功能的測(cè)定：取被動(dòng)免疫40周大鼠，稱重后經(jīng)腹腔注射烏拉坦(1g/kg，i.p)麻醉，經(jīng)右頸總動(dòng)脈行左心室插管，待出現(xiàn)左心室標(biāo)致性波形(圖1)后，穩(wěn)定15-20分鐘，用BL410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)記錄各心功能參數(shù)，包括左心室收縮壓(Left Ve

8、ntricular Systolic Pressure，LVSP)、左心室舒張壓(Left VentricularDiastolic Pressure，LVDP)、室內(nèi)壓上升的最大速率(+dp/dtmax)和室內(nèi)壓下降的最大速率(-dp/dtmx)。
　　 3.激光共聚焦顯微鏡對(duì)被動(dòng)免疫末期大鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣的測(cè)定
　　 3.1心肌細(xì)胞的分離：取被動(dòng)免疫40周大鼠，用1％戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，用Langendorf

9、f灌流裝置經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流酶解心臟為單個(gè)心肌細(xì)胞，放置于高鉀KB(配方見溶液配制)液中，靜置2-4小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 3.2激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope，LSCM)測(cè)定心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣水平：加入有鈣臺(tái)式液(配方見溶液配制)將分離的單個(gè)心肌細(xì)胞懸液復(fù)鈣，負(fù)載Fluo-3/AM熒光指示劑后，加入共聚焦專用皿，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。每只大鼠取10個(gè)視野，選擇桿狀、細(xì)胞

10、膜完整、形態(tài)好的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果用LSM510圖像分析軟件進(jìn)行分析。
　　 4.離子成像系統(tǒng)對(duì)正常大鼠心室肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣的測(cè)定
　　 取健康Wistar大鼠，用上述細(xì)胞分離法獲得單個(gè)心肌細(xì)胞懸液。負(fù)載Fura-2/AM熒光指示劑后，加入離子成像系統(tǒng)的灌流槽內(nèi)中，置于倒置熒光顯微鏡下，分組進(jìn)行測(cè)定：(1)正常對(duì)照組：(Tyrode，n=6)，正常臺(tái)氏液；(2)陰性IgG組：(Negative IgG，n=6)，給予陰性

11、IgG；(3)Isoprenaline組：(Isoprenaline，n=6)，給予1μmol/L的β-AR激動(dòng)劑異丙腎上腺素(Isoprenaline)；(4)β1-AA組：(β1-AA，n=6)，給予0.1μmol/L的β1-AR自身抗體；(5)β1-AA加β1-AR拮抗劑比索洛爾(Bisoprolo1)組：(β1-AA+Bisoprolol，n=6)，同時(shí)給予0.1μmol/L的β1-AA和1μmol/L的Bisoprolol；(

12、6)拮抗劑Bisoprolol組：(Bisoprolol，n=6)，給予1μmol/L的Bisoprolol；(7)β-AA加β1-AR-ECⅡ肽段組：(β-AA+β1-AR-ECⅡ，n=6)，同時(shí)給予0.1μmol/L的β1-AA和1μmol/L的β1-AR-ECⅡ肽段；(8)β1-AR-ECⅡ肽段組：給予1μmol/L的β1-AR-ECⅡ肽段。觀察各組心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣的變化，并與Isoprenaline的作用進(jìn)行比較。
　　

13、 結(jié)果:
　　 1.利用β1-AR-ECⅡ功能表位肽段主動(dòng)免疫大鼠獲得β1-AA
　　 1.1主動(dòng)免疫過程中大鼠體內(nèi)β1-AA水平升高
　　 免疫組大鼠從初次免疫2周后，血清中已有β1-AA的出現(xiàn)，并且滴度迅速升高，在8周時(shí)達(dá)高峰，且明顯高于同期對(duì)照組，表明主動(dòng)免疫成功。
　　 1.2β1-AA蛋白定性及定量測(cè)定結(jié)果
　　 PAGE凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，純化后的抗體在電泳時(shí)，僅有一條帶出現(xiàn)，分子

14、量為160KDa左右，與IgG標(biāo)準(zhǔn)品相一致，表明純化結(jié)果理想。同時(shí)，經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定提取液中蛋白濃度。
　　 2.利用純化后β1-AA成功建立被動(dòng)免疫大鼠模型
　　 2.1被動(dòng)免疫過程中大鼠體內(nèi)β1-AA水平維持與臨床匹配范圍
　　 將β1-AA被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)入正常大鼠體內(nèi)后，動(dòng)物血清中β1-AA水平逐漸升高，在被動(dòng)免疫第16周時(shí)達(dá)到高峰，此后抗體水平開始緩慢下降。各組內(nèi)8、16、32、36、40周比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，

15、但和同一時(shí)間對(duì)照組相比有顯著差異。在整個(gè)被動(dòng)免疫過程中，免疫大鼠血清中β1-AA水平維持在0.19±0.01～0.22±0.02之間，與臨床心臟疾病患者血清中抗體水平接近。
　　 2.2被動(dòng)免疫末期出現(xiàn)大鼠在體心功能下降
　　 β1-AA被動(dòng)免疫第40周時(shí)，免疫組出現(xiàn)了在體心功能下降。其中，被動(dòng)免疫組大鼠左心室室內(nèi)壓上升的最大速率、室內(nèi)壓下降的最大速率顯著低于對(duì)照組；左室舒張壓顯著高于對(duì)照組；左室收縮壓變化不明顯，組間及

16、組內(nèi)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示β1-AA的長期存在導(dǎo)致了大鼠心功能下降。
　　 3.β1-AA長期存在可使大鼠心細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣水平升高
　　 3.1被動(dòng)免疫末期大鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣水平升高
　　 β1-AA被動(dòng)免疫大鼠第40周時(shí)，采用高分辨率的成像清晰的能對(duì)細(xì)胞內(nèi)探針的熒光進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析的LSCM進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，免疫組單個(gè)心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣水平高于對(duì)照組約10倍，提示β1-AA長期存在可以導(dǎo)致單個(gè)心肌細(xì)胞

17、胞內(nèi)游離鈣水平升高。
　　 3.2β1-AA可以通過激活β1-AR途徑升高心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣水平
　　 由于該研究課題需要長時(shí)間監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣水平，為保證實(shí)驗(yàn)過程中心肌細(xì)胞保持良好的狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)利用離子成像系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定，借助灌流裝置用不同處理組氧飽和液體進(jìn)行持續(xù)灌流，來保證測(cè)定結(jié)果的可靠性。結(jié)果顯示，β1-AA可以使正常大鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣水平顯著升高，這一效應(yīng)與β-AR激動(dòng)劑ISoprenaline作用一致。但

18、是，與Isoprenaline不同的是β1-AA增加胞內(nèi)游離鈣的作用是持續(xù)的，可能具有不脫敏性。給予1μmol/Lβ1-AR選擇性拮抗劑Bisoprolol后，可以幾乎完全拮抗β1-AA對(duì)胞內(nèi)游離鈣升高的作用；給予β1-AR-ECⅡ功能表位肽段后，可以逆轉(zhuǎn)β1-AA升高胞內(nèi)游離鈣的作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.用純化的β1-AA長期被動(dòng)免疫可建立與臨床病人抗體水平匹配的心功能不全模型。
　　 2.β1-AA可通