谷子在干旱逆境中差異表達(dá)基因的分離與表達(dá)譜分析.pdf

1、谷子(Setaria italica(L．)Beauv)起源于我國(guó)的黃河流域，在中國(guó)種植已有7000年的歷史，是世界上栽培歷史最悠久的作物之一。谷子耐旱能力強(qiáng)、水分利用效率高，適于在我國(guó)干旱少雨的地區(qū)播種。目前有關(guān)谷子抗旱性分子機(jī)制和從谷子中發(fā)掘抗旱基因的研究幾乎是空白。為了發(fā)掘谷子中的抗旱基因，我們首次利用抑制性差減雜交法構(gòu)建了谷子干旱誘導(dǎo)表達(dá)差減文庫(kù)和干旱抑制表達(dá)差減文庫(kù)，并采用cDNA microarray技術(shù)分析了差減文庫(kù)的表達(dá)

2、譜，篩選獲得了很多有意義的差異表達(dá)片段。文章并報(bào)道克隆到一個(gè)在谷子根中被干旱逆境特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因12氧代植二烯酸還原酶(SiOPRl)，并對(duì)該基因的表達(dá)特性進(jìn)行了詳細(xì)的分析。 實(shí)驗(yàn)首先從魯7060、羊角黃、豫谷5號(hào)、Jun 24和Mar51五個(gè)谷子品種中通過(guò)苗期快速鑒定選出一個(gè)較抗旱品種Mar 51。以品種MaLr 51為研究材料，應(yīng)用20％的PEG6000處理谷子幼苗根系模擬自然干旱逆境，利用抑制性差減雜交法同時(shí)構(gòu)建了干旱誘

3、導(dǎo)表達(dá)差減文庫(kù)(正庫(kù))和抑制表達(dá)差減文庫(kù)(反庫(kù))。正庫(kù)共挑菌2112個(gè)，反庫(kù)共挑菌1372個(gè)，并全部送去測(cè)序。序列經(jīng)過(guò)去載體和去接頭后，拼接在一起，最后正庫(kù)共獲得414個(gè)Contigs和745個(gè)Singletons，合計(jì)1159個(gè)UniESTs。反庫(kù)共獲得136個(gè)Contigs和1804個(gè)Singletons，合計(jì)940個(gè)UniESTs。同時(shí)出現(xiàn)在正庫(kù)和反庫(kù)中的序列數(shù)為150個(gè)，合并正庫(kù)和反庫(kù)在一起共獲得1949個(gè)谷子LlniESTs。

4、測(cè)序出現(xiàn)低的冗余度表明構(gòu)建差減文庫(kù)的均一化水平和差減效率都很高。將1949個(gè)谷子UniESTs按照MIPS進(jìn)行功能分類，共包含21個(gè)大類，占有比例最高的一類是代謝相關(guān)基因，其次是轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因，再次是參與蛋白質(zhì)合成與降解、參與細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝等生物學(xué)過(guò)程的基因。 為了驗(yàn)證差減文庫(kù)和篩除假陽(yáng)性克隆，我們將獲得的1949個(gè)UniESTs點(diǎn)制了cDNA芯片，利用cDNA micromTaV技術(shù)對(duì)差減文庫(kù)進(jìn)行了鑒定和表達(dá)

5、譜分析。結(jié)果表明，受干旱逆境誘導(dǎo)表達(dá)的ESTs在根中共獲得93個(gè)，在地上部中共獲得52個(gè)。受干旱逆境抑制表達(dá)的ESTs在根和地上部中分別獲得10和27個(gè)。在根和地上部中被干旱逆境共同誘導(dǎo)表達(dá)的ESTs僅有5個(gè)，共同抑制表達(dá)的沒(méi)有出現(xiàn)。采用Northem blot雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了cDNA microarray的結(jié)果，在挑選的10個(gè)表達(dá)模式不同的ESTs中，Northem blot雜交結(jié)果都很好地與cDNA microarray實(shí)驗(yàn)的結(jié)

6、果相互印證，有力地說(shuō)明了cDNA microarray實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 谷子幼苗在干旱逆境下的基因表達(dá)譜分析表明，在根和地上部中分別由不同類別的基因參與響應(yīng)干旱逆境，表現(xiàn)出不同的分子機(jī)制。在干旱逆境下谷子中很多基因是被抑制表達(dá)的，因此我們提出負(fù)調(diào)控在谷子適應(yīng)干旱逆境反應(yīng)中起著重要的作用。一個(gè)很有趣的結(jié)果是，在谷子根系早期誘導(dǎo)表達(dá)的基因多數(shù)是參與糖代謝途徑(包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、和糖異生途徑)的酶，說(shuō)明谷子根系在最早期的適應(yīng)性

7、反應(yīng)是基本能量代謝被激活。此外，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)降解和修復(fù)在谷子干旱適應(yīng)性分子機(jī)制中也具有很重要的調(diào)控作用。 為了分析ABA和茉莉酸甲酯(MeJA)兩種植物激素在谷子適應(yīng)干旱逆境中的作用，采用同樣的芯片，分析了ABA和MeJA處理對(duì)谷子基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，被ABA誘導(dǎo)表達(dá)的ESTs在根和地上部中分別有72和135個(gè)，被ABA抑制表達(dá)的ESTs在根和地上部中分別有123和18個(gè)。同時(shí)在根和地上部中被ABA誘導(dǎo)表達(dá)的ESTs僅有2個(gè)

8、，抑制表達(dá)的僅有6個(gè)。在MeJA處理中，在根和地上部中被誘導(dǎo)表達(dá)的ESTs分別有78和10個(gè)，在根和地上部中被抑制表達(dá)的ESTs分別有17和122個(gè)。同時(shí)在根和地上部中被MeJA誘導(dǎo)表達(dá)的EST只有1個(gè)，抑制表達(dá)的也是1個(gè)。聚類分析PEG、ABA和MeJA作用下的基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，PEG處理下的基因表達(dá)模式在根中與MeJA更為接近，在地上部中與ABA更為接近。分別比較PEG與ABA、PEG與MeJA之間基因表達(dá)的重疊圖發(fā)現(xiàn)，重疊基因的數(shù)目

9、并不是太多，因此認(rèn)為在谷子適應(yīng)干旱逆境的調(diào)控途徑中，除ABA和MeJA調(diào)控途徑之外還包括其它的途徑。 從干旱誘導(dǎo)表達(dá)EST中，挑選出兩個(gè)受PEG強(qiáng)烈誘導(dǎo)的ESL，發(fā)現(xiàn)編碼同一個(gè)基因的產(chǎn)物12氧代植二烯酸還原酶。根據(jù)這兩個(gè)EST片段的已知序列，利用RACE技術(shù)首次從谷子中克隆獲得12氧代植二烯酸還原酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為SiOPRl。SiOPRl基因全長(zhǎng)共1360bp，編碼374aa，預(yù)測(cè)分子量為41.9kDa，等電點(diǎn)為

10、5.14。在氨基酸水平上，SiOPRl基因編碼的蛋白質(zhì)在禾谷類作物的不同物種之間保守性很高。不同逆境因子(包括PEG、ABA、NaCI和MeJA)處理的表達(dá)譜分析結(jié)果表明，SiOPRl基因只被干旱逆境處理特異地誘導(dǎo)表達(dá)，而且誘導(dǎo)部位只限制在根中，在地上部不受誘導(dǎo)。ABA、NaCl和MeJA處理對(duì)SiOPRl基因的表達(dá)都沒(méi)有影響。不同組織部位的Northem雜交結(jié)果顯示，SiOPR基因的表達(dá)水平都很低，檢測(cè)沒(méi)有雜交信號(hào)。SiOPR基因在谷