甘藍(lán)型油菜響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)譜分析.pdf

1、油菜(Brassica napus L.)是重要的油料作物之一，地位僅次于大豆，中國是最大的油菜生產(chǎn)國。我國油菜主產(chǎn)區(qū)長江中下游地區(qū)由于降水不均、季節(jié)性干旱造成油菜矮化、不實(shí)，是油菜減產(chǎn)和含油量下降的最主要因素。挖掘油菜抗旱基因是研究油菜抗逆育種的基礎(chǔ)?；蜣D(zhuǎn)錄表達(dá)水平調(diào)節(jié)是植物從分子水平上響應(yīng)干旱脅迫的重要機(jī)制，因此通過轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異來篩選和鑒定抗旱相關(guān)的基因，是挖掘抗旱基因、研究抗旱機(jī)理、提高抗旱育種的重要手段。甘藍(lán)型油菜Q2

2、是具有較強(qiáng)抗性的自交品系，在干旱條件下表現(xiàn)較高的相對含水量(RWC)、抗旱指數(shù)(DRI)以及相對較低的電解質(zhì)滲漏率。利用Q2應(yīng)對干旱脅迫，研究干旱脅迫的分子機(jī)理，挖掘重要的抗旱相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，為抗旱育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本研究以抗旱型甘藍(lán)型油菜Q2為實(shí)驗(yàn)材料，對空氣干旱24h和對照條件下的根和葉片分別提取RNA，進(jìn)行Illumina第二代高通量測序，經(jīng)過序列比對、分析，篩選干旱脅迫條件下的差異表達(dá)基因，并通過突變體抗旱性

3、篩選抗旱基因，挑選了5個(gè)候選基因，并對部分基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，主要結(jié)果如下:
　　1.甘藍(lán)型油菜根和葉片干旱脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組分析
　　以抗旱型甘藍(lán)型油菜Q2為材料，基于Illumina第二代高通量測序RNA-seq技術(shù)，獲得Q2響應(yīng)干旱脅迫轉(zhuǎn)錄本序列信息，根和葉片空氣干旱24h和對照處理總共4個(gè)樣本分別得到12，308，861、11，763，435、11，905，805、12，168，994條cleanreads。測序質(zhì)量

4、評(píng)估結(jié)果表明，測序深度達(dá)到10M，而且70％序列比對到參考基因組，測序質(zhì)量良好。
　　以白菜基因組數(shù)據(jù)庫為參考，對以上兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根和葉片中分別獲得31，240和31，118個(gè)基因。以FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1為標(biāo)準(zhǔn)，根和葉片中分別篩選得到6018和5377個(gè)差異表達(dá)基因。其中，根中上調(diào)基因2448個(gè)，下調(diào)基因3570個(gè);葉片中上調(diào)基因3770個(gè)，下調(diào)基因1607個(gè)。根中下調(diào)基因數(shù)目是葉片中的兩倍

5、，初步顯示了根和葉片干旱脅迫下的調(diào)控模式存在差異。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，大部分差異表達(dá)基因跟脅迫響應(yīng)、刺激響應(yīng)相關(guān);Blast2GO分析表明，根中12條顯著富集的基因功能中，上調(diào)基因富集主要跟脅迫、刺激相關(guān)，而下調(diào)基因主要跟細(xì)胞、功能相關(guān);相反地，葉片中上調(diào)基因主要富集在細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能，下調(diào)基因主要富集脅迫、刺激功能，顯示了干旱脅迫條件下根和葉片分工應(yīng)答脅迫的模式。KEGG富集結(jié)果表明，差異表達(dá)基因主要富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和苯丙素合

6、成路徑。根和葉片中大量轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)激表達(dá)，包括MYB、bHLH、C2H2、AP2/EREBP、NAC等。其中，AP2/EREBP和WRKY在根和葉片相反調(diào)控模式中發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合下游干旱誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件，誘導(dǎo)下游一些基因表達(dá)，包括ERD1、RAB18、RD29B、RD20A、JA-related基因，最終調(diào)控細(xì)胞中Cl-、NO3-、K+、Ca2+等離子水平，改變細(xì)胞膨壓，增加根中細(xì)胞吸水，關(guān)閉氣孔減少葉片蒸騰失水。

7、>　　2.候選基因篩選
　　根據(jù)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果log2Ratio和RPKM值，從差異表達(dá)基因中挑選出與干旱相關(guān)的5個(gè)候選基因TMA7(Bra026774)、BAM3(Bra012676)、SERPIN1(Bra015607)、Peroxidase(Bra009221)、Unknown(Bra009013)，功能分別為翻譯相關(guān)、B-淀粉酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑、過氧化物酶以及功能未知蛋白。將候選基因CDS序列比對到甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫，通過序

8、列比對、測序、克隆，最終確定在甘藍(lán)型油菜Q2中的拷貝數(shù):TMA7有6個(gè)拷貝，BAM3有2個(gè)拷貝，SERPIN1有2個(gè)拷貝，Peroxidase有6個(gè)拷貝，Unknown基因1個(gè)拷貝。
　　3.突變體干旱脅迫條件下的表型觀察
　　根據(jù)5個(gè)候選基因與擬南芥同源基因的信息購買突變體tma7(SALK_044092C)、bam3(SALK_041214C)、serpin1(SALK_019150C)、peroxidase(SALK_

9、124744)、un-2(SALK121527C)，觀察干旱條件下突變體表型發(fā)現(xiàn)，相比較野生型擬南芥(Col)，突變體離體葉片失水率更高、花期提前，表現(xiàn)較強(qiáng)的干旱敏感性，干旱復(fù)水后提早結(jié)實(shí);un-2突變體尤其突出，苗子離體失水后快速皺縮萎蔫。
　　4.候選基因的表達(dá)和功能研究
　　將與白菜候選基因同源性最相近的甘藍(lán)型油菜基因TMA7其中一個(gè)拷貝Bna TMA7，BAM3的2個(gè)拷貝BnaBAM3-C1和BnaBAM3-C2，S

10、ERPIN1的2個(gè)拷貝BnaSERPIN1-C1和BnaSERPIN1-C2，Peroxidase其中1令拷貝BnaPeroxidase，unknown基因1個(gè)拷貝Bnaunknown的特異序列位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，qRT-PCR結(jié)果分析表明，隨著干旱時(shí)間延長，根中7個(gè)基因都應(yīng)激上調(diào)表達(dá);而在葉片中表達(dá)趨勢不盡相同，部分基因下調(diào)表達(dá)。甘藍(lán)型油菜SERPIN1基因啟動(dòng)子GUS染色結(jié)果表明，正常條件下GUS信號(hào)較微弱，主要在子葉葉尖和表皮毛基部、下

11、胚軸、真葉葉尖、以及根中表達(dá)，逆境處理后GUS信號(hào)增強(qiáng)，開始在葉片維管組織中表達(dá)以及根毛生長點(diǎn)處的表達(dá)量增強(qiáng)。
　　5.Bam3基因的功能研究
　　Bam3是一種編碼β淀粉酶的基因。本研究分別克隆了油菜和擬南芥的Bam3-BnaBam3-C1、BnaBam3-C2和AraBam3基因，并對3個(gè)基因在野生型擬南芥中超表達(dá)，進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證。BnaBam3-C1-OE和AraBam3-OE超表達(dá)植株表現(xiàn)開花期提前抽苔期蓮座葉減