從全基因組水平研究PML-RARα融合蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制.pdf

1、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是生命科學(xué)研究的核心,其無論對于了解正常的生理發(fā)育還是異常的疾病發(fā)生過程都有著非同尋常意義.而染色質(zhì)免疫沉淀與高通量基因芯片相結(jié)合的ChiP-on-chip(chromatin immunoprecipitationon chip)技術(shù)則使得人們能夠從全基因組水平研究轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),從而為全面、系統(tǒng)性地研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了一種強(qiáng)有力的手段.在與疾病發(fā)生相關(guān)的模型中,急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelo

2、cytic leukemia,APL)中PML-RARα融合蛋白(異常轉(zhuǎn)錄因子)堪稱是最佳的模型.該融合蛋白能夠與體內(nèi)正常的轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體(RARα)發(fā)生競爭、并與其在DNA上的結(jié)合序列一維甲酸反應(yīng)元件(RAR response elemem,RARE)進(jìn)行結(jié)合、產(chǎn)生顯性抑制(dominantnegative)的效果,從而對一系列與造血細(xì)胞分化相關(guān)的RARa所調(diào)節(jié)的靶基因產(chǎn)生表達(dá)抑制效果,使得細(xì)胞停滯在早幼粒細(xì)胞階段、形成白血病.而

3、全反式維甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)則在相當(dāng)程度上可以逆轉(zhuǎn)PMI-RARα的顯性抑制效果、能夠重新激活與造血細(xì)胞分化相關(guān)的維甲酸受體所調(diào)節(jié)的靶基因.盡管在過去的近二十年中,PML-RARa的研究取得了一系列重要的進(jìn)展,但人們對于PML-RARα所直接涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)了解甚少,尤其在PML-RARα所調(diào)控的靶基因方面更是缺少系統(tǒng)、全面性的研究,缺乏PMI-RARa與下游功能性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有機(jī)聯(lián)系.

4、 因此,本課題以體外轉(zhuǎn)染PML-RARα的細(xì)胞U937-PR9為模型,建立了ChIP以及ChiP-on-chip等技術(shù)平臺并結(jié)合相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從全基因組的水平系統(tǒng)性地研究了PMI,-RARQ異常轉(zhuǎn)錄因子所潛在調(diào)節(jié)的靶基因、并就相關(guān)的下游功能性通路進(jìn)行了較為全面的討論. ChiP-on-chip技術(shù)的成功與否在很大程度上取決于前期ChIP過程的成功與否.因此,本課題首先就該過程中的各主要環(huán)節(jié)進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)控,并通過分析

5、、驗(yàn)證,建立了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),從而使得ChIP技術(shù)在本實(shí)驗(yàn)室成為繼基因芯片技術(shù)、相關(guān)生物信息技術(shù)之后的又一穩(wěn)定的技術(shù)平臺.高質(zhì)量的ChIP平臺為高質(zhì)量的ChiP-on-chip提供了保證.通過對全基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的掃描,本課題共識別了2365個(gè)PMI-RARa的蛋白結(jié)合位點(diǎn),代表了1501個(gè)潛在的靶基因.同時(shí),這些結(jié)合位點(diǎn)在基因組內(nèi)的分布也呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性:如約60﹪以上結(jié)合位點(diǎn)都分布在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(transcriptional sta

6、rt sites,TSS)周圍(上游-2000bp-+2000bp).而這種分布與為數(shù)不多、已報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)分布情況十分吻合.這從另一方面也反映了本研究的可靠性.由于ChIP-on-chip技術(shù)本身存在著假陽性率高、以及部分結(jié)合位點(diǎn)的生物學(xué)基礎(chǔ)不明朗的原因,本課題將"靜態(tài)"的ChlP-on-chip數(shù)據(jù)與"動態(tài)"的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(如APL臨床樣本、APL臨床樣本體外ATRA用藥、NB4細(xì)胞ATRA用藥、APL轉(zhuǎn)基因小鼠ATRA用藥

7、等表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù))進(jìn)行有機(jī)的整合,并進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.只有那些即出現(xiàn)在ChIP-on-chip數(shù)據(jù)中又出現(xiàn)在各種APL相關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)中、同時(shí)在統(tǒng)計(jì)學(xué)多重假設(shè)檢驗(yàn)中具有顯著性差異的基因才被認(rèn)為是PML-RARα所調(diào)節(jié)的靶基因,其中包括:與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的BAG-1、BCL2A1、CFLAR、CLCF1和MCL1等基因;與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑相關(guān)的CHD1、CHD3、CHD4和HMGB2等基因;與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的BHLHB2、IRF1、IR

8、F2、ID2、CEBPE和LMO2等基因;以及和泛素蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)的UBC、UBR2、PSMB8和PSMB10等基因.上述基因所涉及的功能性網(wǎng)絡(luò)大多數(shù)在PML-RARα存在的情況下受到抑制,從而導(dǎo)致正常的血細(xì)胞分化受阻、增殖失控.而ATRA用藥則在相當(dāng)程度上解除了這種抑制、恢復(fù)了細(xì)胞分化的潛能. 本研究的相關(guān)發(fā)現(xiàn)不僅有助于深入了解 APL發(fā)生、及ATRA用藥恢復(fù)過程中分子網(wǎng)絡(luò)的變化,更重要的是為研究其它惡性腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)