全基因組篩選及細胞融合探討腫瘤增殖關鍵基因及轉移相關機制.pdf

1、目的：腫瘤細胞過度增殖及轉移是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的重要特征，也是腫瘤研究的重點和腫瘤治療的關鍵靶點。本課題分別以胰腺癌和黑色素瘤細胞為模型，研究抑制腫瘤細胞過度增殖和轉移的關鍵基因及其機制。
　　 胰腺癌的發(fā)病率死亡率處于癌癥的前十位。胰腺癌確診后往往病情進展迅速，細胞增殖速度快，死亡率高，是臨床預后最差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。本部分課題旨于通過全基因組隨機基因敲除調控技術平臺和CFSE(carboxyfluoresceins

2、uccinimidylester)增殖追蹤方法，篩選抑制腫瘤細胞增殖的關鍵基因，為臨床腫瘤治療提供新的靶點。
　　 黑色素瘤是皮膚腫瘤的主要致死因素，其致死原因主要是黑色瘤的高轉移率，病人在確斷時往往已有淋巴結或遠端器官的轉移。細胞融合是腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中常見的現象之一，在多種腫瘤及其轉移瘤中（如乳腺癌，前列腺癌以及黑色素瘤）都可見腫瘤細胞融合及其引起的多倍體現象，并與疾病的預后呈負相關。本部分課題旨于研究黑色素瘤細胞融合后，

3、腫瘤細胞轉移的病理特征及轉移相關機制。
　　 方法:Ⅰ通過構建基因搜尋載體TNO-PB和建立穩(wěn)定表達tTA并受四環(huán)素調控的細胞系。轉入搜尋載體TNO-PB質粒和轉座酶mPB質粒，篩選獲得全基因組范圍內的胰腺癌隨機基因突變文庫。應用CFSE熒光探針追蹤胰腺癌細胞增殖和流式分選方法分選增殖減慢細胞亞群。所篩選到的細胞克隆通過CFSE追蹤或四甲基偶氯唑鹽(MTT)增殖實驗驗證四環(huán)素介導的基因表達調控。
　　 Ⅱ通過建立改良植物

4、血凝素-聚乙二醇(phytohemagglutinin-polyethyleneglycol，PHA-PEG)細胞融合方法及流式分選方法成功獲得了穩(wěn)定的黑色素瘤融合細胞；流式測定黑色素瘤融合細胞DNA含量；分析黑色素融合細胞的核型及染色體數的變化；體外培養(yǎng)及細胞計數檢測融合細胞的增殖速度；小鼠皮下注射檢測腫瘤生長和尾靜脈注射檢測腫瘤細胞轉移能力；Affymatrix基因芯片分析差異表達的基因和Westemblot測定相關蛋白表達。

5、>　　 結果：Ⅰ構建了TNO-PB全基因組搜尋質粒：建立了穩(wěn)定表達tTA并受DOX調控的胰腺癌細胞株；建立了約74萬+DOX條件篩選的胰腺癌全基因組隨機突變文庫；建立了CFSE追蹤腫瘤細胞增殖的方法和流式分選增殖減慢細胞群的方法及克隆法篩選增殖減慢克隆的方法。通過以上方法成功篩選到并通過后期的驗證確定其為受DOX調控的增殖減慢克隆，為進一步研究腫瘤增殖減慢關鍵基因打下了基礎。
　　 Ⅱ成功得到了單一穩(wěn)定的黑色素融合細胞。黑色素

6、瘤融合細胞的體積和DNA含量均發(fā)生翻倍變化，染色體由多2倍體轉變?yōu)槎?倍體。體外增殖實驗顯示黑色素瘤融合細胞的體外增殖速度明顯減慢，體內生長曲線也顯示黑色瘤融合細胞的皮下腫瘤生長速度減慢：但黑色素瘤融合細胞轉移能力明顯增強?；蛐酒治鼋Y果顯示黑色素瘤融合細胞與增殖相關的PI3K-AKT通路明顯下調。Westem分析驗證融合細胞中PI3K-AKT通路下游蛋白phospho-S6表達明顯降低。提示細胞融合通過PI3K-AKT通路降低黑色素

7、瘤細胞增殖能力?；蛐酒@示與黑色素轉移相關的β-tubulin2基因表達顯著提高（＞10倍）。
　　 結論：在胰腺癌細胞模型中成功建立了約74萬+DOX條件下篩選的胰腺癌全基因組突變文庫。建立了CFSE追蹤腫瘤細胞增殖方法以及流式法分選增殖減慢細胞群、克隆法篩選增殖減慢克隆方法。成功得到了受DOX調控的胰腺癌增殖減慢克隆。為腫瘤的增殖抑制研究提供了新的研究方法。
　　 在黑色素瘤細胞模型中建立了高效的PHA-PEG細胞