華支睪吸蟲CsSP15新基因的發(fā)現(xiàn)及其表達產(chǎn)物免疫學(xué)功能初步研究.pdf

1、目的：利用生物信息學(xué)方法對新發(fā)現(xiàn)的華支睪吸蟲基因CsSP15編碼的蛋白進行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測，并利用基因工程技術(shù)進行克隆和表達，獲得相應(yīng)的重組蛋白，初步研究重組蛋白的免疫學(xué)特性，探討其作為診斷候選抗原分子的潛在價值。 方法：華支睪吸蟲成蟲CsSP15的生物信息學(xué)分析；CsSP15基因的克隆、表達和純化；重組蛋白的免疫學(xué)功能研究。 結(jié)果：①CsSP15生物信息學(xué)分析。CsSP15基因全長590bp，含有4個可能的開放讀碼框，最

2、大的開放讀碼框(ORF)位于51-515bp，含465bp，編碼155aa，起始密碼ATG，終止密碼TGA，理論分子量為17.10kDa，等電點PI為8.55。CsSP15基因序列的BLASTX結(jié)果顯示，與CsSP15同源性最高的為日本血吸蟲功能未知蛋白基因(登錄號：56752713、567554146)，一致性達43％，相似性達63％；CsSP15基因推導(dǎo)的氨基酸序列與多個物種附睪分泌蛋白的氨基酸序列有一定的同源性。利用ExPASY中

3、SignalP程序在線分析發(fā)現(xiàn)：CsSP15序列的氨基端有一段剪切位點位于地17-18位氨基酸之間的信號肽。RPS—BLAST和InterProScan程序?qū)sSP15功能域搜索，發(fā)現(xiàn)其具有參與胞內(nèi)膽固醇的識別和轉(zhuǎn)運的機構(gòu)域Npc2和ML結(jié)構(gòu)域，還具有與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的Der—P—2樣結(jié)構(gòu)域。②CsSP15基因的克隆、表達和純化。利用基因的特異性引物擴增出CsSP15目的片段，定向克隆獲得的重組原核表達質(zhì)粒pGEX—4T-1-CsSP1

4、5經(jīng)PCR、雙酶切和測序證實構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式成功表達出融合蛋白，經(jīng)SDS—PAGE顯示與理論預(yù)測的融合蛋白分子量相符。CsSP15-GST融合蛋白經(jīng)切膠純化成功。③融合蛋白的免疫學(xué)功能研究。純化的CsSP15-GST蛋白免疫大鼠，獲得了大鼠抗CsSP15和抗GST的免疫血清。Western blotting顯示CsSP15-GST融合蛋白能被處理組免疫血清和大鼠感染血清所識別，而對照免疫血清和陰性大鼠血清不

5、能識別融合蛋白。通過ELISA檢測不同感染度病人血清總IgG發(fā)現(xiàn)：在輕、中、重度各16例的華支睪吸蟲病人中陽性檢出數(shù)分別為13、14、11。故在48例陽性病人血清中，陽性檢出數(shù)38例，敏感性達79.16％。 結(jié)論：⑴純化的CsSP15-GST融合蛋白具有免疫原性和抗原性。⑵CsSP15并非蟲體結(jié)構(gòu)蛋白，可能是蟲體的分泌蛋白，是華支睪吸蟲分泌排泄抗原組分之一。⑶重組CsSP15用于華支睪吸蟲血清學(xué)診斷的敏感性約79.16％，對輕度