CGRP和NGF對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注Fas和ICAM-1表達(dá)的影響及對(duì)受損神經(jīng)元的保護(hù)作用.pdf

1、目的：臨床上許多疾病(如腦血栓形成、腦栓塞、心跳驟停、休克等)都可導(dǎo)致腦缺血的發(fā)生。腦缺血發(fā)生后引起的病理生理過(guò)程復(fù)雜，可出現(xiàn)神經(jīng)元壞死、變性、遲發(fā)性神經(jīng)元死亡和/或凋亡，目前尚無(wú)有效安全的治療方法。以Fas系統(tǒng)為代表的死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞凋亡最主要的途徑之一。 缺血再灌注后，血腦屏障的破壞是造成再灌注損傷的重要基礎(chǔ)，其中ICAM-1起著重要作用。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是第一個(gè)利用基因重組技術(shù)發(fā)現(xiàn)的由37個(gè)氨基酸組成

2、的活性多肽，有強(qiáng)烈的舒張腦血管效應(yīng)，可預(yù)防和緩解腦血管痙攣。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，可促進(jìn)神經(jīng)元的分化，維持神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育，促進(jìn)受損神經(jīng)元的修復(fù)。CGRP和NGF廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并與腦缺血再灌注損傷有一定關(guān)系。CGRP和NGF對(duì)受損神經(jīng)元的保護(hù)作用的機(jī)制尚待研究。所以，我們通過(guò)線栓法阻斷大鼠MCA制備局灶性腦缺血再灌注模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、原位雜交組織化學(xué)和顯微圖像分析等方法，研究外源性C

3、GRP和NGF對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注Fas蛋白和mRNA、ICAM-1蛋白和mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以及對(duì)缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷和腦梗塞體積的影響，探討CGRP和NGF對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。為缺血性腦血管病的病理生理機(jī)制的研究和治療方法的選擇及腦保護(hù)藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠162只，體重250～300克，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為：(1)假手術(shù)組(sham，n=6)；

4、(2)缺血再灌注組(I/R)；(3)CGRP治療組；(4)NGF治療組；(5)CGRP和NGF治療組。其中缺血再灌注組、CGRP組、NGF組、CGRP和NGF組在局灶性腦缺血2h后，又分為再灌注6h、12h、24h、48h和72h組，每組動(dòng)物6只(n=6)。 2.局灶性腦缺血再灌注模型的制備大鼠10％水合氯醛腹膜腔注射麻醉(350mg/kg體重)，取頸前正中切口，分離結(jié)扎右頸外動(dòng)脈、右頸總動(dòng)脈，分離右頸內(nèi)動(dòng)脈；在右頸總動(dòng)脈結(jié)扎處

5、與右頸內(nèi)動(dòng)脈起始部之間切口(或用5號(hào)注射針頭刺一口)，將涂有硅酮直徑0.28mm的尼龍線小心插入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈約18.0±1.0mm，即可閉塞大腦中動(dòng)脈，外留栓線10mm，固定栓線，縫合皮膚。2h后再次麻醉動(dòng)物后剪開(kāi)皮膚縫線，手術(shù)顯微鏡下輕輕拔出栓線約10mm以實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組除不插栓線、不注射藥物外，其余步驟同上。 再灌注開(kāi)始前經(jīng)左頸外動(dòng)脈插入套管針至左頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)備用。缺血再灌注組：缺血2h后開(kāi)始再灌注時(shí)經(jīng)套管針向左頸內(nèi)動(dòng)脈

6、內(nèi)注入生理鹽水1ml，30min注射完；NGF組：注入NGF(500U/ml，1ml，大連司威特公司)，30min注射完；CGRP組：注入CGRP(1μg/ml，1ml，美國(guó)Sigma公司)，30min注射完；NGF與CGRP合用組：注入NGF(1000U/ml，0.5ml)和CGRP(2μg/ml，0.5ml)，30min注射完。注射完畢后拔出套管針，結(jié)扎左頸外動(dòng)脈。 缺血再灌注各組在局灶性腦缺血2h再灌注6h時(shí)，參考ZeaL

7、onga等的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分，評(píng)分后制備冰凍切片，TTC染色測(cè)定梗塞體積，HE染色光鏡下觀察大鼠皮質(zhì)、海馬的組織學(xué)變化。 3.神經(jīng)功能損傷觀測(cè)按照Z(yǔ)eaLonga5級(jí)評(píng)分法評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。動(dòng)物入選的標(biāo)準(zhǔn)：取評(píng)分為1、2、3分的動(dòng)物。 4.HE、TTC染色觀察海馬組織病理學(xué)變化冰凍

8、切片經(jīng)37℃涼干，常規(guī)HE染色，TTC染色，光鏡下觀察假手術(shù)組和缺血再灌注組大鼠海馬組織病理學(xué)變化，及梗塞灶。 5.免疫組織化學(xué)、原位雜交檢測(cè)和顯微圖象分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理進(jìn)行免疫組織化學(xué)、原位雜交檢測(cè)各組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。用10％水合氯醛(350mg/kg體重)腹膜腔注射麻醉，快速開(kāi)胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，肝素生理鹽水快速?zèng)_洗至清澈，再用含4％多聚甲醛的0.1mol/LPBS(含1/1000DEPC)灌注固定，斷頭取腦

9、，取兩耳極連線前6mm左右冠狀切面組織塊分成2塊，置入同一固定液中后固定1h。蒸餾水充分洗滌，一塊常規(guī)制成石蠟塊，另一塊置入含30％蔗糖的0.1mol/LPBS溶液(含1/1000DEPC)4℃過(guò)夜沉底后，用冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，厚16μm，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)和原位雜交檢測(cè)。用MetaMor-ph(美國(guó))圖象分析系統(tǒng)測(cè)定各組海馬CA1區(qū)Fas蛋白和mRNA、ICAM-1蛋白和mRNA免疫陽(yáng)性反應(yīng)物的平均灰度值，所得

10、數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件以?xún)蓸颖揪鶖?shù)間t檢驗(yàn)及方差分析多樣本均數(shù)間兩兩比較等方法作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果：1.神經(jīng)功能損傷結(jié)果缺血再灌注組大鼠在缺血再灌注后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損傷，其神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)。CGRP和NGF治療組神經(jīng)功能損傷評(píng)分顯著低于缺血再灌注組(P＜0.01)。 2.腦梗塞體積檢測(cè)結(jié)果大鼠局灶性腦缺血再灌注24h后，腦梗塞體積為281±21mm3，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈注射CGRP和

11、NGF后，梗塞體積縮小到226±13mm3，(P＜0.01)。 3.海馬組織病理學(xué)改變假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量多，排列整齊，形態(tài)完整；缺血組神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，分布不均，細(xì)胞周?chē)g隙增寬，有的細(xì)胞體積縮小，核固縮深染。 4.Fas蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果假手術(shù)組未見(jiàn)Fas蛋白免疫陽(yáng)性細(xì)胞，缺血組于再灌注6h后在海馬區(qū)可見(jiàn)Fas蛋白免疫陽(yáng)性細(xì)胞，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，于再灌注24h時(shí)達(dá)高峰，以后開(kāi)始逐漸下降。光鏡

12、下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，主要表達(dá)于細(xì)胞漿。缺血再灌注組Fas蛋白免疫陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值在各時(shí)間段明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)；CGRP組和NGF組平均灰度值在各時(shí)間段均高于I/R組(P＜0.05)；CGRP與NGF合用組Fas蛋白免疫陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值明顯高于CGRP組和NGF組(P＜0.05)。 5.FasmRNA原位雜交檢測(cè)結(jié)果假手術(shù)組未見(jiàn)FasmRNA免疫陽(yáng)性細(xì)胞，缺血再灌注組在頂葉、海馬區(qū)可見(jiàn)FasmRNA免疫陽(yáng)性細(xì)

13、胞。光鏡下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞漿。在各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，CGRP組和NGF組FasmRNA陽(yáng)性反應(yīng)物的平均灰度值高于I/R組(P＜0.1)；CGRP與NGF合用組FasmRNA免疫陽(yáng)性反應(yīng)物的平均灰度值明顯高于CGRP組和NGF組(P＜0.01)。 6.ICAM-1蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)及海馬未見(jiàn)ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞，其平均光密度值只是其背景的非特異性反應(yīng)；缺血組于再灌注6h后在海馬區(qū)可見(jiàn)ICAM-1陽(yáng)性

14、細(xì)胞，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，大腦皮質(zhì)及海馬ICAM-1表達(dá)進(jìn)一步增加，于再灌注24h時(shí)明顯，以后開(kāi)始逐漸下降；光鏡下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞漿。注射CGRP、NGF及CGRP&NGF后大腦皮質(zhì)及海馬ICAM-1表達(dá)明顯減少，CGRP組和NGF組平均光密度值在各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于I/R組(P＜0.01)，CGRP組與NGF組比較平均光密度值無(wú)明顯差異(P＞0.05)，CGRP與NGF合用組平均光密度值低于CGRP組和NGF組(P＜0

15、.05)。 7.ICAM-1mRNA原位雜交檢測(cè)結(jié)果假手術(shù)組未見(jiàn)ICAM-1mRNA免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，缺血再灌注組在海馬區(qū)可見(jiàn)ICAM-1mRNA免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。光鏡下免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞漿。CGRP組和NGF組ICAM-1mRNA陽(yáng)性反應(yīng)物的平均灰度值高于缺血再灌注組(P＜0.01)；CGRP與NGF合用組ICAM-1mRNA陽(yáng)性反應(yīng)物的平均灰度值明顯高于CGRP組和NGF組(P＜0.01)。 結(jié)論：1.

16、CGRP和NGF治療組神經(jīng)功能損傷顯著低于缺血再灌注組，提示CGRP和NGF對(duì)腦缺血再灌注受損神經(jīng)元的神經(jīng)功能有保護(hù)和恢復(fù)作用。 2.CGRP和NGF治療組顯著減少大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦梗塞體積，說(shuō)明CGRP和NGF對(duì)腦缺血再灌注受損神經(jīng)元有保護(hù)和恢復(fù)作用。 3.大鼠局灶性腦缺血再灌注后Fas蛋白和mRNA，ICAM-1蛋白和mRNA過(guò)表達(dá)，提示Fas及ICAM-1參與腦缺血再灌注損傷的調(diào)亡機(jī)制。 4.CGR