P選擇素L-EGF單抗及N-去硫酸肝素抗胃癌轉移機制研究.pdf

1、胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤轉移為惡性腫瘤致死的關鍵因素。腫瘤轉移至今仍缺乏有效的治療方法。近年有關細胞粘附分子與腫瘤轉移機制的研究已越來越被人們所重視。選擇素是新近確定的一類粘附分子家族，其重要成份之一的P選擇素(GMP140/顆粒表面膜蛋白，分子量140KD)主要分布于中等大小血管內(nèi)皮細胞棒狀小體(Weibel-Palade)及血小板a顆粒，并隨這些細胞活化而迅速表達于細胞膜表面或釋放至血液中。有關研究表明，P選擇素通過介導

2、腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞和血小板之間相互作用，在腫瘤轉移過程中可能起粘附介導作用。近年的研究認為，P選擇素的凝集素與表皮生長因子結構域的共同區(qū)域(L-EGF)可能是其粘附更有效的功能域。體外實驗表明P選擇素L-EGF單克隆抗體，可特異性結合P選擇素，具有抗活化血小板與中性粒細胞粘附的功能。 肝素為高度硫酸化的蛋白多糖，作為抗凝劑，已被廣泛應用于臨床。動物實驗發(fā)現(xiàn)肝素可通過阻止P選擇素的粘附介導作用從而抑制實驗性腫瘤的轉移。因此，肝素可

3、能具有抗腫瘤轉移作用。然而，由于肝素強烈的抗凝活性，限制了它的臨床應用。對肝素進行化學修飾，可降低其抗凝活性，但可增強其抗粘附與抗腫瘤血管形成作用。 本研究用人胃癌組織原位移植SCID小鼠建立胃癌轉移模型，觀察P選擇素L-EGF單克隆抗體和N-去硫酸肝素對胃癌轉移的影響，旨在探討P選擇素I～-EGF單克隆抗體和N.去硫酸肝素對腫瘤轉移的抑制作用及其機制，為P選擇素L-EGF單克隆抗體和N-去硫酸肝素抗腫瘤轉移的臨床應用提供理論基

4、礎。 本文在建立人胃癌組織原位移植SCID小鼠胃癌轉移模型基礎上，研究P選擇素L-EGF單抗對P選擇素表達與胃癌轉移的影響。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)注射P選擇素L-EGF單抗后小鼠的腫瘤轉移率顯著低于生理鹽水對照組。結果表明，P選擇素L-EGF單抗通過抑制腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞、血小板的粘附，從而抑制了腫瘤的轉移。熒光定量PCR測定顯示，正常對照鼠胃組織P選擇素mRNA表達較低，SCID小鼠有癌轉移者其胃癌組織中P選擇素mRNA表達顯著較不伴癌

5、轉移者強，L-EGF單抗組P選擇素mRNA表達較低。表明，P選擇素L-EGF單克隆抗體可通過抑制P選擇素mRNA基因表達而進一步發(fā)揮抗轉移作用。 本文用人胃癌組織原位移植SCID小鼠建立胃癌轉移模型，觀察N-去硫酸肝素對胃癌轉移的影響，研究N-去硫酸肝素對P選擇素表達、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的抑制作用。結果發(fā)現(xiàn)，N-去硫酸肝素組轉移顯著被抑制。熒光定量PCR測定顯示，SCID小鼠伴有癌轉

6、移者其胃癌中P選擇素mRNA表達較不伴癌轉移者明顯增強；生理鹽水組P選擇素mRNA表達較正常小鼠胃組織P選擇素mRNA表達明顯增強，N-去硫酸肝素組P選擇素mRNA表達較生理鹽水組低。免疫組化方法檢測腫瘤組織微血管密度(MVD)、VEGF的表達。熒光定量PCR檢測腫瘤組織VEGFmRNA與bFGFmRNA表達。結果顯示，N-去硫酸肝素組平均微血管密度顯著較生理鹽水組低，生理鹽水組VEGF陽性表達率明顯高于N-去硫酸肝素治療組。熒光定量P

7、CR測定顯示，N-去硫酸肝素組VEGFmRNA與bFGFmRNA表達較生理鹽水組低。N-去硫酸肝素組未出現(xiàn)明顯出血等不良反應。結果表明，N-去硫酸肝素通過抑制腫瘤組織P選擇素表達及VEGF與bFGF表達和血管生成，從而抑制腫瘤的轉移。N-去硫酸肝素無明顯出血等不良反應。 進一步體外實驗予N-去硫酸肝素處理體外培養(yǎng)人胃癌SGC7901細胞，通過ELISA和實時熒光定量PCR方法檢測胃癌細胞VEGF的表達，研究N-去硫酸肝素對胃癌轉

8、移的作用機制。ELISA結果顯示，與陰性對照組相比較，N-去硫酸肝素組人胃癌細胞培養(yǎng)上清液VEGF含量下降，其中0.01mg/mlN-去硫酸肝素劑量組與陰性對照組相比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；0.1mg/mlN-去硫酸肝素組培養(yǎng)24h，VEGF的表達下降有意義(P＞0.05)；1mg/mlN-去硫酸肝素劑量組在12h、24h，VEGF均顯著下降(P＜0.01.)。實時熒光定量PCR結果顯示，N-去硫酸肝素各濃度組胃癌細胞VEGFm

9、RNA表達均顯著下降(P＜0.01)。N-去硫酸肝素對胃癌細胞VEGFmRNA表達的抑制作用為1mg/ml＞0.1mg/ml＞0.01mg/ml(P＜0.01)，存在劑量依賴性。在同一濃度，予N-去硫酸肝素作用24h，胃癌細胞VEGFmRNA表達較12h顯著降低(P＜0.01.)，提示N-去硫酸肝素對胃癌細胞VEGFmRNA表達的抑制作用具有時間依賴性。結果表明，N-去硫酸肝素可以顯著抑制體外培養(yǎng)人胃癌細胞VFGF的表達，且具有時間、劑