miR-34c與CRFR1調(diào)節(jié)大鼠青少年早期應(yīng)激經(jīng)歷致創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙易感性.pdf

1、1.前言：
　　創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是一種特殊形式的焦慮障礙，是指個體在經(jīng)歷或目睹異乎尋常的、嚴(yán)重的威脅性或災(zāi)難性事件后所導(dǎo)致的延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在的反應(yīng)。有研究證實，下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamus-Pituitary-adrenal，HPA）軸的異常激活會導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂和行為異常。因此，HPA軸的功能紊亂是PTSD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因子之一。多項

2、研究結(jié)果表明，PTSD的發(fā)病涉及促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotrophinreleasing factor，CRF)過度分泌或應(yīng)激源誘導(dǎo)的CRH過度反應(yīng)。作為激活和調(diào)節(jié)HPA軸功能的上游關(guān)鍵因子，CRF及其受體CRFR1(corticotrophin releasingfactor receptor1)在焦慮、抑郁和PTSD等情感障礙的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色。
　　眾多研究證實，個體對PTSD的易感性存在差異，而早年

3、應(yīng)激經(jīng)歷是導(dǎo)致PTSD易感性增加的重要因素之一。青少年時期是個體神經(jīng)生物和行為發(fā)展的一個非常關(guān)鍵和特殊的時期，在這期間我們可以觀察到邊緣系統(tǒng)和前額葉皮質(zhì)區(qū)域的特異性改變。在個體早年發(fā)育期間對CRF受體的表達(dá)及其功能進(jìn)行調(diào)節(jié)可能是其相關(guān)神經(jīng)元功能失調(diào)的重要原因，并且該影響可能會持續(xù)終生，這無疑會增加成年期罹患應(yīng)激相關(guān)疾病的易感性。另外，表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠暴露于應(yīng)激環(huán)境時，杏仁核miR-34c表達(dá)水平升高，焦慮樣行為降低，進(jìn)一步研究發(fā)

4、現(xiàn)，miR-34c作用的靶點之一是CRFR1mRNA。但對早年應(yīng)激經(jīng)歷與CRFR1和miR-34c以及PTSD易感性關(guān)系的研究非常有限。許多研究均證實，運動作為一種潛在的非藥物治療手段，對大腦功能以及神經(jīng)元可塑性都大有裨益。本實驗聚焦青少年期創(chuàng)傷應(yīng)激對成年動物焦慮、抑郁行為、HPA軸功能、中樞CRFR1和miR-34c的影響，揭示CRFR1和miR-34c在早年經(jīng)歷致PTSD發(fā)病易感性中的作用，以及規(guī)律跑臺運動對PTSD樣癥狀的調(diào)節(jié)作用

5、。
　　2.目的：
　　(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激對成年期焦慮與抑郁樣行為、記憶、HPA軸功能及CRFR1表達(dá)的作用。
　　(2)規(guī)律跑臺運動與CRFR1拮抗劑對行為、HPA軸功能及CRFR1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　(3)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激對行為學(xué)、CRFR1、CRFR1 mRNA和miR-34c表達(dá)的短期和長期作用;CRFR1拮抗劑對上述指標(biāo)的改善作用。
　　3.方法：
　　(1)實驗分組實驗一:6

6、4只雄性21日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為4組:對照組(CON)、應(yīng)激組(S)、應(yīng)激加運動組(S+E)和應(yīng)激加拮抗劑組(S+A)，每組16只。除去對照組，其它三組均制備PTSD模型。實驗二:72只雄性21日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為三組:對照組(CON)、應(yīng)激組(S)和應(yīng)激加拮抗劑組(S+A)，每組24只。在PTSD造模完成兩周后，每組隨機(jī)抽取12只進(jìn)行行為學(xué)和分子生物學(xué)實驗，其余12只繼續(xù)飼養(yǎng)至成年（造模完成六周后）后進(jìn)行行為學(xué)和分子生

7、物學(xué)實驗。
　　(2) PTSD模型制備將大鼠置于密閉不透光的電擊箱中，大鼠足部收到持續(xù)6s，連續(xù)20次不可逃避的電流刺激，電流強度為8mA。電擊時間間隔隨機(jī)，每次持續(xù)30min。上下午各一次，間隔時間不少于4h，持續(xù)6天。
　　(3) CRFR1拮抗劑CP-154，526的使用方法S+A組動物在PTSD模型建立后第二天腹腔注射CRFR1拮抗劑。將拮抗劑溶于80％的聚乙烯乙二醇400中，劑量為3.2mg/kg/day，持續(xù)1

8、4天。為平衡處理誤差，其它組的動物腹腔注射80％的聚乙烯乙二醇400。
　　(4)跑臺運動訓(xùn)練程序?qū)嶒炓恢械腟+E組的動物在PTSD模型建立后第二天開始為期六周，每周五次的跑臺運動。
　　(5) DEX/CRH聯(lián)合試驗實驗一行為學(xué)實驗結(jié)束之后，每組隨機(jī)抽取8只大鼠接受DEX/CRH聯(lián)合試驗。
　　(6)行為學(xué)測試實驗一在造模完成六周后進(jìn)行行為學(xué)測試，試驗二分別在造模完成后兩周和六周進(jìn)行行為學(xué)測試。行為學(xué)測試包括曠場試驗

9、、高架十字迷宮試驗，Y迷宮試驗和Morris水迷宮測試。
　　(7)免疫組化檢測CRFR1表達(dá)實驗一行為學(xué)測試結(jié)束以后，隨機(jī)抽取大鼠處死，腦組織分離后用蠟塊包埋。內(nèi)側(cè)前額葉、下丘腦、海馬和杏仁核的組織切片方向為冠狀，厚度為5微米，隨后采用免疫組化染色方法檢測CRFR1表達(dá)。
　　(8)免疫印跡分析CRFR1表達(dá)取內(nèi)側(cè)前額葉、下丘腦、海馬和杏仁核組織在冰上勻漿，勻漿液在低溫離心機(jī)中以14000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘，取上清液。測

10、得蛋白濃度后以一定的比率與上樣緩沖液混合95℃加熱變性。取總量20微克的蛋白于12％的凝膠中電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。牛奶封閉后，PVDF膜加一抗4℃過夜，第二天PBST漂洗后加二抗室溫孵育一小時。PBST漂洗后加入ECL發(fā)光液顯影，條帶的灰度值使用Image J14.0軟件計算。
　　(9)實時定量PCR檢測CRFR1mRNA和miR-34c取50-100mg的下丘腦組織，加入1毫升Trizol提取總RNA。取1mlRNA采用實時

11、定量PCR的方法用來檢測CRFR1 mRNA和miR-34c。其相對表達(dá)量用以下公式計算，2^-[(Ct ofCRFR1 mRNA)-(Ct of GAPDH)]以及2^-[(Ct of miR-34c)-(Ct of U6)]。
　　4.結(jié)果：
　　(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠成年期出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為、記憶功能損害、HPA軸功能失調(diào)和CRFR1表達(dá)異常。
　　(2)長期規(guī)律的跑臺運動和CRFR1拮抗劑CP-1

12、54，526的長期應(yīng)用可明顯改善大鼠中樞CRFR1的表達(dá)。與CRFR1拮抗劑相比，跑臺運動對減輕大鼠成年期的焦慮和抑郁樣行為，改善其記憶功能，穩(wěn)定HPA軸功能的效果更好。
　　(3)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激在兩周內(nèi)導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為增加和記憶功能損傷，同時下丘腦miR-34c表達(dá)上調(diào)，CRFR1表達(dá)降低。
　　(4)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠成年后的焦慮樣行為增加和記憶功能損傷，CRFR1表達(dá)升高，但下丘腦miR-34c表達(dá)與

13、對照組相比無明顯差異。
　　(5) CRFR1拮抗劑CP-154，526明顯升高青少年期和成年期下丘腦miR-34c表達(dá)水平。
　　5.結(jié)論：
　　(1)青少年早期創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致大鼠持續(xù)至成年的情緒、記憶、HPA功能以及中樞CRFR1表達(dá)異常。
　　(2)中樞CRFR1表達(dá)異常和下丘腦miR-34c表達(dá)異常在早年應(yīng)激經(jīng)歷致成年期PTSD發(fā)病易感性中發(fā)揮重要的作用。
　　(3)長期規(guī)律運動和CRFR1拮抗劑可