bHLH基因ngn1、ngn3和ash1體外誘導(dǎo)雞胚RPE再程序化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元.pdf

1、目的：
　　 原發(fā)或繼發(fā)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞變性最終導(dǎo)致不可逆盲。這類疾病臨床上目前尚無有效的治療措施，因為神經(jīng)元是不可再生的細胞。眾多的實驗方法中，細胞移植替代技術(shù)最有可能成為一種治療神經(jīng)元變性的有效途徑。細胞替代治療成功的首要前提是：有穩(wěn)定的、免疫組織相容程度高的供體細胞。本論文旨在探討雞胚視網(wǎng)膜色素上皮細胞能否被活化型bHLH基因neurogenin1(ngn1)、ngn3和ash1在體外再程序化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元并且鑒定不同基因

2、誘導(dǎo)的神經(jīng)元類型。
　　 方法：
　　 neurogenin1(ngn1)，ngn3和ash1的全長mRNA序列克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒RCAS前病毒載體中，于雞胚纖維母細胞中組裝病毒，收集并提純一定濃度的病毒顆粒。RCAS-GFP作為對照病毒。清潔級受精雞蛋孵育到胚胎第2.5天(E2.5)時視網(wǎng)膜下分別顯微注射攜帶三種基因病毒懸液。因RCAS在雞胚體內(nèi)可以整合到細胞中，并隨細胞的分裂增殖得到擴散，所以發(fā)育中分裂旺盛的胚眼視網(wǎng)膜

3、神經(jīng)層和色素上皮可以被攜帶基因的病毒感染。病毒感染率通過對病毒蛋白P27的表達情況監(jiān)測進行推測。注射后的雞胚繼續(xù)孵育到一定發(fā)育階段(E6，E7.5或E12)時，RPE組織從胚眼中分離并平鋪于Transwell()插入培養(yǎng)皿中體外培養(yǎng)一定時間。為了排除血清中的生長因子(如bFGF)對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，一律采用含20％血清替代品的Knock-out DMEM細胞培養(yǎng)液。體外培養(yǎng)一段時間后，將RPE組織固定并以O(shè)CT/蔗糖混合物冷凍包埋，然后

4、制作5-10μm的冰凍切片。常規(guī)熒光標記的免疫組織化學(xué)染色法及改良的原位雜交技術(shù)用于檢測感染病毒的攜帶的三種基因能否將RPE細胞再程序化。此處指的改良原委雜交技術(shù)是指，常規(guī)原位雜交顯色完成后加一步細胞脫色素的過程以利于原位雜交信號觀察。實驗中所用的視網(wǎng)膜感光細胞標記包括：視錐蛋白(visinin)：視錐細胞細胞內(nèi)的一種鈣結(jié)合蛋白；視紅素、視紫紅質(zhì)，感光器間視黃醇類結(jié)合蛋白片段(IRBP)等視色素；光傳導(dǎo)通路中涉及的a.轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(α-tr

5、ansducin，ALT)以及突觸相關(guān)蛋白SNAP-25和PSD-95等。視網(wǎng)膜節(jié)細胞的標記蛋白包括RA4，Brn3A和3A10等。另外尚使用Calretinin識別水平細胞，雙極細胞，無長突細胞和節(jié)細胞；LIM(4H6)識別水平細胞。通過研究RPE細胞本身特有的基因mmp115(115 kDa大小的melanosomal matrix protein)的表達水平，了解RPE過表達活化型bHLH基因后自身特質(zhì)的改變。同時也檢驗了在眼部組

6、織發(fā)育過程中起重要作用的基因Pax6和chx10的水平變化。RPE再程化過程中的細胞增值能力通過檢查細胞整合bromodeoxyuridine(BrdU)的情況進行評價。在ngn1處理的RPE細胞內(nèi)通過同時標記visinin和BrdU了解光感受器細胞生成過程是否伴隨細胞增殖。
　　 結(jié)果：
　　 為使RPE組織可以有效的黏附在transwell()膜上，最早固定的一批標本為分離、培養(yǎng)后4小時，此時ngn3處理的RPE組織

7、中有較多的visinin陽性細胞出現(xiàn)，ngn1處理者僅有極個別細胞為visinin陽性，而ash1處理的組織中未見神經(jīng)元特意性蛋白表達。2-3天以后ngn1,ngn3處理的組織內(nèi)均見到大量的visinin+細胞，個別部位夾雜RA4+，Calretinin+和H5+細胞。這些visinin+細胞在8DIV尤其是16DIV時表達諸多較成熟的感光細胞特有的標記基因：視紅素，視紫紅質(zhì)IRBP和ALT以及突觸相關(guān)蛋白SNAP-25和PSD-95。

8、GFP對照組織中Pax6的表達較少，其在ngn1過表達組織中的特點為：visinin+細胞中的表達水平高，而visinin+細胞中Pax6表達明顯減少。visinin+細胞中mmp115的表達量明顯下調(diào)。另外，E18 RPE組織體外加入RCAS-ngn3后在15DIV同樣有大量的visinin+細胞可以檢測到。組織培養(yǎng)伊始加入BrdU，培養(yǎng)兩天后，無論在對照組還是處理組，均可觀察到有多數(shù)細胞整合BrdU。BrdU和visinin的雙標記

9、顯示大部分visinin+細胞為兩種分子雙標記，有小部分細胞只表達visinin。RCAS-ash1可將RPE組織向不同的方向再程序化，子細胞表達多種蛋白：visinin，RA4，3A10，Brn3A，Calretinin和4H6。但即使在體外培養(yǎng)的第16天，visinin+細胞內(nèi)未見有視紅素等視色素表達。
　　 結(jié)論：
　　 RPE組織在體外可以旺盛增殖。RCAS-ngn1或ngn3過表達的情況下RPE組織丟掉了它們作