遠(yuǎn)志根提取物對小鼠實(shí)驗(yàn)性腸炎作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景和目的： 炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)和克羅恩氏病(Crohn's disease，CD)，是一種反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確，主要涉及環(huán)境、遺傳、感染、免疫功能紊亂等多方面因素。其中免疫因素在IBD發(fā)病中的作用日益受到重視，成為研究的熱點(diǎn)。目前主要用5.氨基水楊酸類制劑、糖皮

2、質(zhì)激素及免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)劑等治療本病，但其副作用較大，嚴(yán)重影響其廣泛應(yīng)用，故尋找開發(fā)有效治療IBD的新型藥物成為目前IBD領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 中醫(yī)多將本病歸于“泄瀉”、“痢疾”等范疇，多根據(jù)不同癥狀表現(xiàn)分為多種證型進(jìn)行對證治療。遠(yuǎn)志根具有“安神益智……瘡瘍腫毒”等治療作用，作為臨床中醫(yī)藥治療的常用藥物，其療效機(jī)理目前尚不清楚。為探討遠(yuǎn)志根提取物對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效，本研究利用三硝基苯磺酸(trinitrobenzene su

3、lfonie acid，TNBS)誘導(dǎo)的小鼠IBD模型觀察遠(yuǎn)志根藥物對IBD模型的影響，并對其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。 材料與方法： 1、IBD模型小鼠的制備雄性BALB/c小鼠，用含1.0mg的TNBS 50％乙醇溶液100μl灌腸造模，對照組則給予灌腸生理鹽水，實(shí)驗(yàn)對小鼠一般情況、疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activityindex，DAI)評分、結(jié)腸肉眼觀及病理切片組織學(xué)評分等指標(biāo)的觀察、測定。 2、

4、建立TNBS小鼠結(jié)腸炎模型，應(yīng)用2g生藥/kg，4g生藥/kg劑量的遠(yuǎn)志根提取物于制模后24小時(shí)開始灌胃，每日一次，對模型小鼠進(jìn)行干預(yù)研究。觀察遠(yuǎn)志根提取物對腸炎模型的治療效果。 3、遠(yuǎn)志根提取物對TNBS小鼠腸炎折作用機(jī)制探討采集結(jié)腸標(biāo)本，應(yīng)用RT-PCR的方法檢測結(jié)腸組織中白細(xì)胞介素-4(interleukinl-4，IL-4)mRNA、干擾素(interferon，IFN)-γ mRNA的相對表達(dá)。沿結(jié)腸縱軸剖開，使用含有青霉素-

5、鏈霉素的生理鹽水洗結(jié)腸組織以去除腸腔內(nèi)殘留糞便后，使用不含鈣鎂的EDTA平衡鹽溶液在37℃的水平搖床中孵育20分鐘以分離上皮內(nèi)的淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞，重復(fù)操作兩次。然后，將組織剪碎，放入含1mg/ml Ⅰ型膠原酶的RPMI 1640中，并置于37℃ 5％ C02培養(yǎng)箱內(nèi)消化2小時(shí)。粘膜固有層單核細(xì)胞(lamina propria mononuclearcclls，12MCs)在40％70％Percoll梯度界面處被收集。使用anti-CD

6、3和anti2CD28體外刺激，培養(yǎng)48h后，收集上清液，留待酶聯(lián)免疫反應(yīng)(enzyme linked immunosorbent assay，ELJSA)法檢測IL-4和IFN-γ的含量。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過ELISA法測定12MCs培養(yǎng)上清中l(wèi)L-4和IFN-γ的濃度。 4、應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均使用x±s表示，采用進(jìn)行配對資料t檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 1、T

7、NBS/乙醇溶液灌腸后，小鼠出現(xiàn)腹瀉、便血等癥狀，其體重的明顯減輕，DAI、結(jié)腸肉眼觀及組織學(xué)損傷評分增加，至造模10天，模型小鼠仍維持腸粘膜的炎癥性病變。結(jié)合人類IBD的病理特征及臨床癥狀，通過對這種模型病理變化及癥狀的對比觀察，認(rèn)為tNBS模型小鼠病變類似于人類CD。 2、兩遠(yuǎn)志根提取物組均能在TNBS造模后給藥9天，可明顯減輕模型小鼠腹瀉、便血等癥狀，抑制其體重的減輕，減少DAI并明顯改善其結(jié)腸肉眼觀及組織學(xué)損傷，表明遠(yuǎn)志

8、根提取物對TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有一定的治療作用，但兩劑量組之間無明顯的差異性。 3、應(yīng)用RT-PCR的方法檢測結(jié)腸組織中IL-4mRNA和IFN-γmRNA的相對表達(dá)。TNBS模型組結(jié)腸組織中IFN-γ mRNA的表達(dá)水平明顯高于對照組(p<0.01)，IL-4 mRNA：濃度降低(p<0.01)，遠(yuǎn)志根提取物治療組的IFN-γmRNA的表達(dá)水平顯著下降，IL-4mRNA表達(dá)水平升高。通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)法測定12MC

9、s培養(yǎng)上清中IL-4和IFN-γ的濃度，模型組中IL-4的含量明顯低于對照組，兩治療組與模型相比較，IL-4的濃度高于模型組。模型組的IFN-γ的濃度顯著升高。兩治療組LPMC中濃度明顯減低。兩治療組之間無顯著性差異。結(jié)論： 1、對BALB/c小鼠給予1.0mg·只-1TNBS/乙醇溶液灌腸可成功誘導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)性腸炎。 2、遠(yuǎn)志根提取物對TNBS誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型有一定的治療作用。兩種不同劑量的遠(yuǎn)志根提取物組之間沒有明顯的量