IL-33參與小鼠實驗性腸炎的作用及其機制HMGB1參與小鼠同種心臟移植早期排斥的作用機制.pdf

1、克羅恩病(Crohn’s Disease,CD)是一種慢性、復發(fā)性、原因不明的胃腸道慢性炎性肉芽腫性疾病,臨床特征主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛和腸梗阻,并有惡變傾向?？肆_恩病確切病因迄今仍不清楚,一般認為可能與免疫、遺傳、感染等因素相關(guān)。目前已知,Th1/Th17細胞應(yīng)答在CD進展中起重要作用,另外免疫負調(diào)控機制紊亂也發(fā)揮關(guān)鍵性作用。上述免疫失衡狀態(tài)可引發(fā)一系列下游炎性反應(yīng),從而致腸道組織損傷。
　　IL-33(又名NF-HEV或IL-1

2、F11)屬IL-1家族成員,廣泛表達于全身組織,尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道組織顯著高表達,提示其在這些組織病理生理過程中可能發(fā)揮作用。ST2L是IL-33唯一的特異性受體,主要表達于Th2細胞、肥大細胞、NKT細胞等表面,但Th1細胞不表達。IL-33功能十分復雜,在不同疾病及微環(huán)境中其作用各異。近期雖已有文獻報道CD和潰瘍病中IL-33表達升高,但其確切作用及機制尚未闡明。
　　本課題以TNBS所致小鼠實驗性腸炎為CD模型,探討

3、IL-33參與CD的作用及可能機制。
　　一、重組小鼠IL-33的原核表達及兔源抗IL-33多克隆抗體的制備
　　本課題組前期研究已成功構(gòu)建mrIL-33-GST原核表達質(zhì)粒。復蘇已轉(zhuǎn)化mrIL-33表達質(zhì)粒的大腸桿菌,IPTG體外誘導下擴增、表達、純化,并剪切GST標簽,獲取高純度IL-33并驗證其生物活性。委托公司制備兔抗小鼠IL-33多克隆抗體。
　　二、rIL-33參與小鼠實驗性腸炎的作用
　　1.TNB

4、S所致腸炎模型小鼠腸道組織高表達IL-33
　　建立小鼠腸炎模型后第四天,采集模型組(TNBS)和對照組(乙醇)小鼠結(jié)腸組織并提取蛋白,免疫印跡檢測其IFN-γ、IL-17、IL-33表達。結(jié)果顯示:TNBS處理鼠IL-33、IFN-γ、IL-17表達均顯著高于乙醇對照組,且IL-33主要以全長形式存在;模型組腸道組織IL-33 mRNA表達水平也顯著升高。免疫組化檢測結(jié)果提示:IL-33主要表達于形態(tài)類似單核細胞的細胞漿中。免疫

5、熒光檢測清晰顯示,IL-33主要表達于F4/80陽性巨噬細胞;巨噬細胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬細胞同樣證實表達IL-33。
　　2.rIL-33明顯緩解TNBS所致小鼠腸炎
　　小鼠經(jīng)TNBS處理后,立即分別給予rIL-33或兔源IL-33多克隆抗體(pAb),以PBS和兔IgG分別作為對照,以小鼠體重改變反映腸炎進展,結(jié)果顯示:IL-33可顯著緩解TNBS誘導腸炎的進展,而抗IL-33pAb可加劇腸炎進展(體重減輕

6、)。結(jié)腸的肉眼觀察評分也獲相同結(jié)果。結(jié)腸組織免疫組化檢測步顯示,IL-33處理的小鼠結(jié)腸組織炎性細胞浸潤顯著減少。TNBS處理小鼠后第二天給予IL-33,同樣可延緩腸炎進展。
　　三、rIL-33誘導腸炎模型小鼠由Th1應(yīng)答向Th2應(yīng)答偏移并誘生Treg
　　1.rIL-33誘導Th1/Th2細胞應(yīng)答偏移
　　TNBS所致腸炎小鼠經(jīng)IL-33處理,分析血清及腸系膜淋巴結(jié)(MLN)細胞培養(yǎng)上清中不同細胞因子水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

7、,IL-33處理組與PBS組相比,Th2型細胞因子IL-5、IL-13水平升高,Th1型細胞因子IFN-γ明顯減少。提取腸道組織總mRNA分析細胞因子表達,獲相同結(jié)果:rIL-33處理組Th1型細胞因子(IFN-γ、IL-6、TNF-α)顯著減少,Th2型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)明顯升高。實驗結(jié)果還表明,IL-33處理的小鼠MLN和固有層單個核細胞(LPMC)中ST2+CD4+T比例增高,提示IL-33主要作用于ST2

8、+CD4+T細胞而發(fā)揮效應(yīng)。
　　2.IL-33誘生Treg
　　TNBS所致腸炎小鼠經(jīng)IL-33處理,分析腸道組織Foxp3(Treg特征性轉(zhuǎn)錄因子)及其主要效應(yīng)分子IL-10 mRNA表達。結(jié)果顯示:rIL-33處理小鼠Foxp3和IL-10 mRNA表達顯著高于PBS對照組。LPMC中Foxp3蛋白表達在兩組間具有顯著性差異。已有文獻報道,Treg/Th17細胞失衡在CD發(fā)病中起重要作用,但本課題未發(fā)現(xiàn)rIL-33導致

9、Th17細胞下降。
　　3.rIL-33誘生的Treg細胞在緩解TNBS所致小鼠腸炎進展中起關(guān)鍵作用
　　體內(nèi)應(yīng)用抗IL-4、CD25抗體分別中和IL-4并阻斷Treg細胞免疫抑制功能,結(jié)果顯示:抗CD25抗體可逆轉(zhuǎn)rIL-33對腸炎的保護作用,而抗IL-4抗體不能明顯逆轉(zhuǎn)rIL-33的保護作用。
　　四、rIL-33誘生Treg細胞的機制
　　1.rIL-33促進CD103+IDO+DC分化
　　文獻報道

10、,CD103+DC(屬耐受DC亞群)在維持腸道組織微環(huán)境免疫自穩(wěn)中起關(guān)鍵作用。本實驗結(jié)果顯示:rIL-33處理實驗性腸炎小鼠,MLN細胞和LPMC中CD103+DC比例明顯升高,且CD103+DC亞群高表達 IDO。
　　2.rIL-33間接通過腸上皮細胞(IEC)而誘導CD103+DC
　　為探討rIL-33誘生CD103+DC的機制,體外用GM-CSF刺激BMDC,同時給予外源性IL-33。結(jié)果顯示,IL-33并不影響骨

11、髓細胞向CD103+DC分化,且對已分化的BMDC也無影響。文獻報道,IEC所產(chǎn)生TSLP/ALDH1A1/TGFβ1在CD103+DC分化中起重要作用。我們據(jù)此推測,IL-33可能作用于IEC。實驗結(jié)果顯示:IEC可表達ST2L(IL-33的受體);rIL-33處理腸炎小鼠IEC,可明顯上調(diào)TSLP和ALDH1A1 mRNA表達;rIL-33處理小鼠IEC的培養(yǎng)上清可誘導BMDC上調(diào)CD103表達。
　　3.體外經(jīng) rIL-33

12、刺激的腸炎小鼠IEC培養(yǎng)上清可上調(diào)DC表達CD103并促進Treg細胞分化
　　在建立小鼠TNBS腸炎后第四天,分離其IEC體外培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):rIL-33可誘導IEC高表達TSLP/ALDH1A1 mRNA,而TGF-β1無明顯變化(此結(jié)果與體內(nèi)檢測一致);經(jīng)rIL-33刺激的IEC培養(yǎng)上清,可有效促進CD103+DC分化;培養(yǎng)上清誘生的CD103+DC可誘導nave T細胞分化為具有免疫負調(diào)節(jié)作用的Treg細胞。
　　五

13、、結(jié)論
　　1.實驗性小鼠腸炎模型中,腸道組織浸潤的巨噬細胞可高表達IL-33。
　　2.給予外源性rIL-33可顯著緩解TNBS所致小鼠腸炎進展。
　　3.TNBS所致小鼠腸炎模型中,IL-33可逆轉(zhuǎn)Th1應(yīng)答,并使之向Th2/Treg應(yīng)答偏移。
　　4.IL-33主要通過誘導Treg細胞分化而緩解TNBS所致小鼠腸炎。
　　5.IL-33主要作用于IEC而促進CD103+IDO+DC分化,繼而誘生Tre