多孔組織工程材料捕獲細(xì)胞的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體,已廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療。干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞,成體干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞。成體干細(xì)胞由于取材方便,沒有倫理學(xué)限制和安全性等問題,成為目前臨床應(yīng)用中最主要的干細(xì)胞,如：間充質(zhì)干細(xì)胞,造血干細(xì)胞等。研究證實(shí)成體骨髓、肌肉、脂肪等組織都存在間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞,但體內(nèi)各組織中干細(xì)胞比例極低,直接從機(jī)體獲取干細(xì)胞數(shù)量非常有限。因此尋找新的干細(xì)胞來源或者新的干細(xì)胞獲取方法是目前國內(nèi)外

2、干細(xì)胞研究的熱點(diǎn),也是臨床需要解決的一個(gè)難題。本文利用多孔組織工程材料植入動(dòng)物體內(nèi),探索一種新的、高效的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞獲取方法。在前期研究中發(fā)現(xiàn)體內(nèi)埋植多孔組織工程材料方法所捕獲細(xì)胞中存在造血干細(xì)胞,且捕獲細(xì)胞中貼壁細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物,但捕獲細(xì)胞中是否存在間充質(zhì)干細(xì)胞需要進(jìn)一步證實(shí),且捕獲細(xì)胞中造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的比例和應(yīng)用價(jià)值也需要進(jìn)一步探索。
　　 目的：①通過對(duì)多孔組織工程材料捕獲造血干細(xì)胞進(jìn)行

3、定量分析,并與骨髓中造血干細(xì)胞比例進(jìn)行比較,探索多孔組織工程材料捕獲造血干細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值。②證實(shí)捕獲細(xì)胞中間充質(zhì)干細(xì)胞的存在,比較捕獲間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓、肌肉間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性,探索多孔組織工程材料捕獲間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值。③探討捕獲間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)假肥大型肌營養(yǎng)不良癥模型鼠(mdx鼠)的治療作用。
　　 方法：⑴移植多孔明膠海綿到小鼠后肢大腿內(nèi)側(cè)肌間隙,分別在3d、6d、9d、12d、15d、18d取出材料,稱取海綿

4、重量,計(jì)數(shù)捕獲細(xì)胞數(shù)。用胎盤藍(lán)拒染法、集落形成細(xì)胞檢測(cè)法等方法檢測(cè)捕獲細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中細(xì)胞活力和造血干細(xì)胞頻率。⑵差速貼壁法分離捕獲細(xì)胞,骨髓和肌肉中的間充質(zhì)干細(xì)胞,用倒置顯微鏡、成纖維細(xì)胞集落形成單位(CFU-F)檢測(cè)法、細(xì)胞計(jì)數(shù)、體外誘導(dǎo)分化及細(xì)胞染色等方法比較三者的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞頻率、增殖能力和多向誘導(dǎo)分化能力等生物學(xué)特性。此外,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)捕獲間充質(zhì)干細(xì)胞“多能”表面標(biāo)志物的表達(dá),性染色體標(biāo)記法初步探索捕獲細(xì)胞中干細(xì)胞的

5、來源。⑶將正常雄性C57BL/6小鼠的捕獲間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞肌肉多點(diǎn)注射移植入雌性mdx鼠體內(nèi),以未治療mdx鼠和健康C57BL/6小鼠為對(duì)照組。12周后通過強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的運(yùn)動(dòng)能力變化,肌肉組織HE染色檢測(cè)肌肉病理的改變,應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR、Western-blot檢測(cè)腓腸肌dystrophin蛋白的表達(dá),另進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)移植治療mdx鼠腓腸肌內(nèi)sry基因。
　　 結(jié)果：①第12天時(shí)捕獲細(xì)胞數(shù)量達(dá)

6、到最大值;捕獲細(xì)胞的活力明顯弱于骨髓細(xì)胞(P＜0.05);誘導(dǎo)14天后,捕獲細(xì)胞的造血集落相似于骨髓細(xì)胞;但頻率和各種克隆的頻率均高于骨髓(p＜0.05),但兩者來源各種造血克隆比比較接近。②捕獲細(xì)胞貼壁細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、肌肉間充質(zhì)干細(xì)胞有相似的細(xì)胞形態(tài),增殖能力,骨、軟骨和脂肪誘導(dǎo)分化能力,但捕獲細(xì)胞中CFU-F的比例高于骨髓細(xì)胞和肌肉細(xì)胞中比例(P＜0.05)。此外,捕獲間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)“多能”表面標(biāo)志物rex-1和nanog

7、,而不表達(dá)oct-4。捕獲細(xì)胞中的干細(xì)胞可來源于外周循環(huán)血。③捕獲間充質(zhì)干細(xì)胞治療組mdx鼠較未治療組mdx鼠運(yùn)動(dòng)功能似乎有所改善,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);肌肉病理明顯改善,肌纖維核內(nèi)移明顯減少(P＜0.05);dystrophin蛋白陽性表達(dá)。但與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療效果相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。另外,移植治療的雌性mdx鼠腓腸肌sry-基因均為陽性。
　　 結(jié)論：⑴最佳的埋植時(shí)間是12天,捕獲細(xì)胞中的造血