肝癌導(dǎo)向肽結(jié)合蛋白的篩選及其功能研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是一種分布范圍廣、危害嚴(yán)重的致死性疾病，我國是肝癌高發(fā)地區(qū)，每年至少有12萬人死于原發(fā)性肝癌。然而在臨床上對肝癌目前尚缺乏根治性的治療方法，究其原因主要與我們對肝癌發(fā)生、發(fā)展的機理還知之甚少，對肝癌細(xì)胞具有的特殊生物學(xué)特性及其分子機理還有待于進(jìn)一步深入研究。因此加強肝癌基礎(chǔ)理論的研究，提升有效的早期診斷和治療技術(shù)具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。 本實驗的前期工作是利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選與肝癌特異性結(jié)合的導(dǎo)向肽，已

2、經(jīng)建立了多種篩選方法，尤其是在荷瘤動物模型中的體內(nèi)篩選技術(shù)，同時建立了一套腫瘤特異性導(dǎo)向肽在體內(nèi)外靶向作用的鑒定技術(shù)。目前已經(jīng)篩選獲得了多條特異性結(jié)合于肝癌組織的導(dǎo)向肽，并獲得了中國發(fā)明專利。本論文在此基礎(chǔ)上，擬利用獲得的三種肝癌細(xì)胞特異性導(dǎo)向肽(A54、WP05和JY96)，通過固相生物淘洗和免疫學(xué)技術(shù)從己構(gòu)建的肝癌cDNA表達(dá)文庫中篩選出這些導(dǎo)向肽的結(jié)合蛋白基因，并分析這些基因與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間的聯(lián)系，同時通過親和分離技術(shù)從肝癌組

3、織蛋白提取液中分離與這些導(dǎo)向肽相互作用的結(jié)合蛋白。 本論文主要分成以下幾個部分： 一、肝癌導(dǎo)向肽的體外結(jié)合活性鑒定在前期工作中我們篩選獲得了一系列能夠特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞的噬菌體肽，然而體外化學(xué)合成的肽是否還能保持這一導(dǎo)向特性還需要進(jìn)一步驗證。我們采用化學(xué)合成的方法合成了多肽WP05、JY96和A54，并對其進(jìn)行羧基熒光素(FAM)標(biāo)記，通過體外結(jié)合活性來驗證這些導(dǎo)向肽與肝癌細(xì)胞的特異性結(jié)合作用。經(jīng)驗證，化學(xué)合成的WP05

4、、JY96和A54肽確實能在體外與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合，為分離導(dǎo)向肽在肝癌細(xì)胞上的結(jié)合蛋白奠定了理論基礎(chǔ)。 二、肝癌cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建及肝癌導(dǎo)向肽結(jié)合蛋白基因的篩選通過cDNA表達(dá)文庫篩選策略分離肝癌特異性導(dǎo)向肽WP05、JY96和A54的結(jié)合蛋白基因。以人肝癌細(xì)胞BEL-7402的裸鼠移植瘤為材料，構(gòu)建了肝癌cDNA表達(dá)文庫，原始文庫滴度為6.1×10<'7>pfu/ml，重組率99.3％，擴增后滴度1.4x10<'11>p

5、fu/ml，達(dá)到了用于目的基因分離篩選和克隆表達(dá)的建庫要求。以生物素(Biotin)標(biāo)記的導(dǎo)向肽為探針，同時采用固相篩淘法和免疫學(xué)方法篩選cDNA文庫。實驗結(jié)果顯示：利用導(dǎo)向肽WP05從文庫中篩選到了SNX27基因；利用導(dǎo)向肽JY96篩選到RBXl基因。三、siRNA抑制SNX27基因表達(dá)對肝癌細(xì)胞的影響SNX27是通過導(dǎo)向肽WP05從肝癌cDNA表達(dá)文庫中篩選到的基因。SNX27基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)上調(diào)表達(dá)，因此我們通過RNA干擾技術(shù)分析

6、SNX27基因與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間的相互關(guān)系。RNA干擾采用siRNA真核表達(dá)載體的方法誘導(dǎo)。通過在線siRNA設(shè)計工具設(shè)計SNX27基因干擾靶序列，利用pAS質(zhì)粒構(gòu)建siRNA真核表達(dá)載體pAS/SNX27i。通過轉(zhuǎn)染試劑將pAS/SNX27i轉(zhuǎn)染到BEL-7402細(xì)胞中，分析RNA干擾抑制效率，分別檢驗了SNX27基因表達(dá)被抑制的腫瘤細(xì)胞在增殖、粘附和遷移的變化。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后SNX27基因的表達(dá)抑制效率達(dá)到了29-5％。SNX2

7、7表達(dá)抑制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生如下變化：增殖速率顯著下降；細(xì)胞粘附性下降，與對照細(xì)胞相比差異極顯著(P=0.00084<0.005)；細(xì)胞遷移性下降，與對照細(xì)胞相比差異顯著(0.05>P=0.0016>0.001)。四、siRNA抑制RBXl基因表達(dá)對肝癌細(xì)胞的影響RBXl是通過導(dǎo)向肽JY96從肝癌cDNA表達(dá)文庫中篩選到的基因。經(jīng)差異表達(dá)分析，RBXl在肝癌細(xì)胞BEL-7402中呈上調(diào)表達(dá)，提示其可能與肝癌有一定聯(lián)系。構(gòu)建RBXl基因的s

8、iRNA真核表達(dá)載體pAS/RBXli，通過轉(zhuǎn)染試劑將pAS/RBXli轉(zhuǎn)染到BEL-7402細(xì)胞中，檢驗RBXl基因表達(dá)被抑制的腫瘤細(xì)胞增殖、粘附和遷移的變化。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后RBXl基因的表達(dá)抑制效率達(dá)到了68.6％。RBXl表達(dá)抑制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生如下變化：增殖幾乎完全停滯；細(xì)胞粘附性下降，與對照相比差異極顯著(P=0.0003<0.005)；細(xì)胞遷移性下降，與對照相比差異極顯著(P=0.0007<0.005)。 四、肝癌

9、蛋白的提取及肝癌導(dǎo)向肽結(jié)合蛋白的親和分離為分離得到肝癌導(dǎo)向肽A54的結(jié)合蛋白，我們嘗試從肝癌組織蛋白中用親和分離技術(shù)獲得A54肽的結(jié)合蛋白。從荷瘤裸鼠模型腫瘤組織中提取肝癌組織蛋白。以Biotin-A54肽作為親和分離介質(zhì)，通過多種親和分離技術(shù)從提取的肝癌組織蛋白中獲得能與A54肽相互作用的結(jié)合蛋白。經(jīng)對洗脫蛋白的質(zhì)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)洗脫蛋白為分子量為67kDa的一組蛋白，其中包括已有報導(dǎo)的潛在腫瘤膜標(biāo)志蛋白HSC71。經(jīng)生物信息學(xué)分析，

10、HSC71蛋白具有能與A54肽相互作用的空間結(jié)構(gòu)。從上面的實驗我們可以得到以下結(jié)論： 1．通過體外的細(xì)胞結(jié)合實驗，證明了導(dǎo)向肽WP05、JY96和A54能夠與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合； 2．成功構(gòu)建了人肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的cDNA表達(dá)文庫，達(dá)到了用于目的基因分離篩選和克隆表達(dá)的建庫要求； 3．利用導(dǎo)向肽WP05從cDNA表達(dá)文庫中篩選到SNX27基因； 4．利用導(dǎo)向肽JY96從cDNA表達(dá)文庫中篩選到RBXl基

11、因； 5．成功構(gòu)建了SNX27基因siRNA真核表達(dá)載體pAS/SNX27i，轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞后，對SNX27基因表達(dá)抑制效率達(dá)到29.5％，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、粘附及其遷移。 6．成功構(gòu)建了RBX1基因siRNA真核表達(dá)載體pAS/RBXli，轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞后，對RBX1基因表達(dá)抑制效率達(dá)到68.6％，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、粘附及其遷移。 7．嘗試通過親和分離方法分離導(dǎo)向肽A54的結(jié)合蛋白，