登革2型病毒與內(nèi)皮細胞表面整合素β-,3-相互作用的研究.pdf

1、本實驗用DV2感染真皮微血管來源的HMEC-1和來源于人臍靜脈內(nèi)皮細胞的ECV304細胞株，檢測DV2在兩種內(nèi)皮細胞中的增殖規(guī)律，病毒感染后細胞表面整合素的表達及功能的變化，以及細胞表面的整合素在DV2感染中的作用，探討DV2感染與VEC相互作用的分子機制。主要的實驗結(jié)果如下： (1)DV2感染可以上調(diào)整合素β<,3>在HMEC-1和ECV304細胞中的表達 首先，采用流式細胞技術(shù)，檢測DV2感染的HMEC-1及ECV3

2、04細胞表面的整合素β<,1>和β<,3>的表達，樣品的平均熒光強度代表了整合素的表達量。在整合素β<,3>的檢測中，HMEC-1感染后24hr，感染組平均熒光強度略高于對照組，隨著感染時間的延長，樣品的平均熒光強度逐漸增加，在感染后72hr達到峰值，是對照組的2.54倍(P<0.01，n=3)。說明DV2感染增強了整合素β<,3>在HMEC-1中的表達。整合素β<,1>的表達量于感染前后沒有明顯變化。ECV304細胞感染后，整合素β<

3、,1>和β<,3>呈現(xiàn)了與HMEC-1相似的變化趨勢。用感染復(fù)數(shù)(MOI)為1的病毒量感染HMEC-1時，上清中的病毒量于感染后72hr達峰值，為1.6×10<'5>PFU/ml。這與感染后整合素β<,3>高表達的時相點一致，提示DV2對細胞的感染可能誘導(dǎo)了整合素β<,3>的表達。 同時，我們用實時定量(real time)RT-PCR的方法檢測整合素β<,3>的mRNA水平。利用2<'-△△Ct>的分析方法分析，整合素β<,3

4、>的mRNA水平在DV2感染：HMEC-1后逐漸升高，在感染后72hr達到峰值，是對照組的14.48倍(p<0.01，n=3)，與流式細胞儀分析的結(jié)果趨勢一致。進一步證明DV2感染能夠上調(diào)整合素β<,3>的表達。 我們的結(jié)果與Raymond等在漢坦病毒的研究結(jié)果一致，Raymond等研究發(fā)現(xiàn)致病性漢坦病毒可以選擇性抑制整合素β<,3>直接介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞移行，流式細胞分析顯示整合素β<,3>的表達量明顯升高。其原因目前尚不清楚，但

5、我們知道整合素β<,3>是細胞表面的一種糖蛋白受體，通過與細胞外基質(zhì)的親和力的變化，控制細胞的粘附和移行。整合素β3正常的生理功能的發(fā)揮有賴于這種受體與配體結(jié)合/解離的平衡。所以兩種出血熱病毒均可引起整合素β<,3>的表達量升高，而臨床上卻表現(xiàn)為出血、血漿滲出，這一看似矛盾的現(xiàn)象可能是由于整合素β<,3>過量表達，引起了細胞粘附與移行這一平衡的紊亂，造成血管通透性變化所致。DV2感染上調(diào)整合素的表達對整合素β<,3>功能的影響有待進一步

6、研究。 對于DV2感染后整合素表達上調(diào)的分子機制，我們也做了初步的研究。蛋白質(zhì)的mRNA水平高，一般由兩方面因素決定，一是啟動子活性增強，轉(zhuǎn)錄水平增高；二是mRNA降解減緩，導(dǎo)致的mRNA半衰期的延長。對于前者比較容易確定，本實驗即用整合素啟動子系列報告基因載體pGL3-1k和pGL3-1.3K，檢測DV2感染后整合素表達上調(diào)是否由于整合素啟動子活性增強，轉(zhuǎn)錄水平增高造成的。3次獨立實驗的結(jié)果顯示，無論是ECV304細胞還是Ve

7、ro細胞，DV2感染后各時相點，整合素啟動子的活性均沒有明顯的變化。那么整合素表達量的變化，可能是病毒感染導(dǎo)致的mRNA降解減緩，mRNA半衰期的延長造成的，其中具體的作用機制還需要進一步證明。 (2)免疫熒光染色顯示HMEC-1中整合素β<,3>與DV2的E蛋白共存 用整合素β<,3>的單克隆抗體與DV2 E蛋白的抗體對DV2感染后的HMEC-1進行免疫熒光雙染色。未感染的HMEC-1用整合素β<,3>的單克隆抗體染色

8、，呈現(xiàn)較弱的熒光。感染后24hr熒光的強度無明顯變化，隨著感染時間的延長，整合素β<,3>抗原的熒光強度逐漸增強，在感染后48hr和72hr，細胞均呈現(xiàn)較強的熒光。整合素β<,3>抗原主要分布在核周和細胞膜上，與細胞內(nèi)的DV2 E蛋白抗原有明顯的共存。利用ECV304細胞，實施相同的感染實驗，所得結(jié)果與HMEC-1一致。整合素β<,1>抗原在感染前后的熒光強度沒有明顯變化，提示整合素β<,3>可能與DV2的感染過程密切相關(guān)。 (

9、3)阻斷整合素αvβ<,3>的功能可部分的抑制DV2進入HMEC-1和ECV304細胞 本實驗先用整合素β<,1>，αv，αvβ<,3.的功能阻斷抗體或配體纖維結(jié)合蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和玻粘蛋白(vitronectin，VTN)與培養(yǎng)細胞共孵育，觀察對DV2進入細胞的抑制作用。在25μg/ml的濃度下，整合素αv和αvβ<,3>的功能阻斷抗體分別可以抑制30％and38％的DV2進入HMEC-1。100μg/ml

10、的FN和VTN的阻斷效率分別為32％和23％(n=3)。整合素β<,1>的功能阻斷抗體，牛血清白蛋白(BSA)以及正常小鼠的IgG1在相應(yīng)的濃度下均未出現(xiàn)阻斷效果。利用ECV304細胞，實施相同的感染進入阻斷實驗，所得結(jié)果與HMEC-1一致。提示整合素β<,3>在DV2進入細胞的過程中可能發(fā)揮比較重要的作用。 (4)可溶性整合素αvβ<,3>可以有效的阻斷DV2進入HMEC-1和ECV304細胞 為進一步證明整合素αvβ

11、<,3>在介導(dǎo)DV2進入內(nèi)皮細胞中的特異性作用，在實施DV2感染實驗之前，先用可溶性的整合素αvβ<,3>或αvβ<,3>與病毒孵育?？扇苄缘恼纤卅羦β<,3>可以有效的阻斷DV2的感染，其阻斷作用具有劑量依賴特性。在2.5μg/ml的濃度下，僅出現(xiàn)部分阻斷作用，當濃度達到10μg/ml時，阻斷率幾乎可達100％。而可溶性整合素αvβ5在10μg/ml的濃度時僅僅可以阻斷約23％的病毒感染(n=3)。BSA則幾乎沒有阻斷作用。結(jié)果提示

12、整合素αvβ<,3>可能特異性的與DV2相互作用，從而阻斷病毒感染細胞。 (5)RNA干擾方法下調(diào)整合素β<,3>的表達，可降低DV2的感染率 為進一步證實整合素αvβ<,3>是否為DV2進入宿主細胞所必需的，我們用RNA干擾的方法下調(diào)整合素β<,3>的表達。構(gòu)建特異性針對人整合素β<,3>的干擾質(zhì)粒p1262和p1932，轉(zhuǎn)染ECV304細胞后48hr用流式細胞計數(shù)法檢測瞬時轉(zhuǎn)染的干擾效果：轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細胞平均熒光強

13、度均比對照組(轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pSlienser)有明顯下降，提示本次構(gòu)建的干擾質(zhì)粒確實可以降低整合素β<,3>的表達水平。在此基礎(chǔ)上，我們通過G418，篩選了低表達整合素β<,3>的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。經(jīng)過2輪篩選，共得到5個細胞克隆，其中轉(zhuǎn)染p1262的有兩株(G6，F(xiàn)8)，轉(zhuǎn)染p1932的有三株(9-1，F(xiàn)10，G10)，流式細胞計數(shù)顯示G6中整合素β<,3>的表達水平下降最為明顯，僅為對照組的38％。我們將G6克隆命名為ECV-β<,3>

14、(-)。利用上述細胞株進行DV2感染實驗，與對照組相比，在ECV-β<,2>(-)中，DV2的感染率下降了89％，提示整合素β<,3>可能是DV2進入ECv304細胞所必需的。 (6)在CHO-K1細胞中重建整合素β<,3>受體可以提高DV2的感染率 CHO-K1是來源于中國倉鼠卵巢上皮的細胞系，常用于異源整合素的表達。用DV2感染CHO-K1細胞后不同時相點取培養(yǎng)上清，進行病毒滴度測定，發(fā)現(xiàn)病毒在CHO-K1中的增

15、殖滴度較低，最高滴度為1.65×10<'4>PFU/ml。而ECV304細胞或Vero細胞，在相同的感染條件下，DV2的最高滴度可達1.34×10<'6>pFU/ml和1×10<'7>pFU/ml。本實驗將表達人整合素β<,3>的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞，用G418篩選單克隆細胞，通過流式細胞檢測，建立了穩(wěn)定表達整合素β<,3>的CHO-K1細胞。利用該細胞株進行感染實驗，觀察了人整合素β<,3>穩(wěn)定表達的CHO-K1對DV2易感性的變

16、化。 與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的對照組CHO-K1細胞相比，發(fā)現(xiàn)DV2進入穩(wěn)定表達整合素β<,3>的CHO-K1細胞株的病毒量有所增高，增高的比例與整合素β<,3>的表達增高趨勢基本一致，進一步說明了整合素αvβ<,3>在DV2感染過程有重要作用。CHO-F8細胞是所篩選到的整合素β<,3>表達最高的細胞克隆，感染后0hr進入細胞中的病毒為5×10<'2>pFU，而相同的感染條件下進入ECV304細胞或Vero細胞的病毒可達5×10<'4>

17、pFU。因此認為，整合素β<,3>是DV2進入內(nèi)皮細胞所必需的蛋白，但不是惟一的蛋白，若要確定還有哪些蛋白參與了DV2進入內(nèi)皮細胞的過程，尚需要進一步研究。 綜合上述結(jié)果，DV2感染可以誘導(dǎo)整合素β<,3>高水平的表達，整合素β<,3>的表達上調(diào)可能有助于病毒進入宿主細胞。本實驗的結(jié)果為揭示整合素β<,3>在DV感染的病理過程中的作用提供了重要的理論基礎(chǔ)。對于整合素β<,3>與病毒蛋白的結(jié)合位點以及DV2感染上調(diào)整合素β<,3>