血管緊張素Ⅱ促進(jìn)酒精性肝纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 腎素-血管緊張素.醛固酮系統(tǒng)(RAA)是一類血管調(diào)節(jié)因子，近年來發(fā)現(xiàn)RAAS中的血管緊張素II(Ang II)還有上調(diào)細(xì)胞因子、促進(jìn)細(xì)胞增生和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝等非血流動力學(xué)作用，能夠促進(jìn)心臟和腎臟纖維化的形成，其在肝纖維化發(fā)生中的作用也日益受到關(guān)注。
　　 肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了驗證Ang II在酒精性肝纖維化發(fā)生中的作用及其作用環(huán)節(jié)，我們應(yīng)用乙醇灌胃法制備了酒精性肝纖維化動物

2、模型，觀察了酒精性肝纖維化過程中血漿AngII的動態(tài)變化和ACEI類藥物Captopril對酒精性肝纖維化形成的影響；并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用原代HSC細(xì)胞培養(yǎng)觀察了Ang II對HSC增殖、膠原分泌和TGF-β1、p38 MAPK表達(dá)的影響，以明確Ang II在酒精性肝纖維化發(fā)生中的作用及其作用機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點。
　　 材料和方法：
　　 1、酒精性肝病動物模型制備
　　 雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，

3、分別給予乙醇及Captopril灌胃。
　　 2、肝臟組織病理學(xué)檢查
　　 肝臟標(biāo)本置于福爾馬林中固定，石蠟包埋，HE及VG染色，觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)改變。
　　 3、血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)檢測
　　 應(yīng)用放射免疫分析法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。
　　 4、血漿、肝組織內(nèi)血管緊張素II(Ang II)水平檢測
　　 應(yīng)用放射免疫分析法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。
　　 5

4、、I、IV型膠原免疫組織化學(xué)染色
　　 采用SABC法。結(jié)果應(yīng)用病理圖像分析儀對染色強(qiáng)度和染色面積進(jìn)行分析，分析時每張切片選取陽性染色最明顯的10個視野。
　　 6、肝星狀細(xì)胞分離、培養(yǎng)
　　 參照宋少剛等[33]報道的方法分離肝星狀細(xì)胞。
　　 7、HSC鑒定
　　 (1)細(xì)胞存活的鑒定：吸取90μl細(xì)胞懸液，加入0.4％臺盼藍(lán)溶液10μl，混勻后光鏡下未著色者為活細(xì)胞。
　　 (2)性

5、質(zhì)鑒定：SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，胞漿Desmin陽性者為HSC。
　　 8、細(xì)胞增殖率測定
　　 采用MTT比色法。
　　 9、HSCα-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　 采用SP免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法。
　　 10、αl(I)、αl(IV)型膠原實時定量PCR(realtime quantitativePCR)
　　 采用SYBR Green I熒光染料嵌合法。
　　 11、上清液TGF

6、-β1測定
　　 采用雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測。
　　 12、p38 MAPK測定
　　 采用Western blot方法。
　　 13、p38 MAPK抑制劑SB203580對HSC增殖、TGF-β1、αl(I)、αl(IV)型膠原表達(dá)的影響
　　 采用Western blot方法。
　　 結(jié)果:
　　 1、一般情況觀察
　　 酒精組大鼠毛色晦暗，豎毛，反應(yīng)遲鈍，

7、食欲不佳，體重下降；而ACEI組大鼠活躍，毛色光滑，體重持續(xù)增長。整個實驗過程中酒精組大鼠死亡率最高。
　　 2、肝臟病理組織學(xué)染色結(jié)果
　　 HE及VG染色結(jié)果顯示：對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無變性、壞死和炎細(xì)胞浸潤，無纖維組織增生。酒精組4w末即出現(xiàn)局限性肝小葉中央靜脈區(qū)小泡狀脂肪變，肝細(xì)胞點片狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤；12w末，形成彌漫性混合性脂肪變，并可見中央靜脈及匯管區(qū)周圍纖維組織增生，竇周亦有明顯的纖維組織增生。而A

8、CEI組8w末才出現(xiàn)局限性輕度脂肪變性，肝細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤均不明顯；12w末脂肪變略有增加，無纖維條索形成。
　　 3、血清透明質(zhì)酸、層粘連蛋白檢測結(jié)果
　　 實驗8w末時酒精組血清LN濃度開始升高，實驗12 w末時酒精組血清LN濃度進(jìn)一步升高，明顯高于對照組和ACEI組。ACEI組血清LN濃度與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4、血漿、肝組織內(nèi)血管緊張素II水平檢測結(jié)果
　　 實驗8w末ACEI組血漿

9、Ang II水平開始升高(t=54，P<0.0005)。隨實驗時間延長并進(jìn)一步的升高，但仍維持于較高水平。
　　 實驗4w末酒精組肝組織內(nèi)AngII水平即開始高于對照組(t=7.51，P<0.0005)。并隨實驗時間延長繼續(xù)升高。
　　 5、I、IV型膠原免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
　　 對照組大鼠中I型膠原主要分布于匯管區(qū)的結(jié)締組織、血管壁及膽管壁，在肝實質(zhì)內(nèi)沿肝竇壁形成的絲狀著色。ACEI組I型膠原的分布部位與對照

10、組基本一致，陽性面積百分比與對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.054)，較酒精組明顯減少(P<0.0005)。 IV型膠原在對照組主要位于中央靜脈、匯管區(qū)的血管壁。酒精組可見大量的IV型膠原沉積于增生的纖維間隔內(nèi)，并且在肝竇間隙亦可見沿肝竇壁連續(xù)分布的強(qiáng)陽性線性染色。ACEI組IV型膠原的分布部位與對照組基本一致。病理圖像分析結(jié)果顯示酒精組IV型膠原陽性面積百分比與對照組及ACEI組比較均顯著升高(P<0.0005)，ACEI組與對照組

11、比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.055)。
　　 6、AngII促進(jìn)HSC表達(dá)α-SMA
　　 無AngII刺激時，僅見少數(shù)培養(yǎng)的HSC細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)α-SMA弱陽性染色，加入10-8SmoL/L AngII刺激24h后，陽性細(xì)胞百分比明顯上升，加大AngII濃度后陽性細(xì)胞百分比隨之上升(P<0.0005)，并于10-6moL/L AngII時陽性細(xì)胞百分比達(dá)到最高。
　　 7、AngII促進(jìn)HSC增殖
　　 與正

12、常對照組比較，10-8moL/L AngII即可促進(jìn)HSC增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)；升高AngII濃度使HSC增殖活性更加明顯；濃度達(dá)10-6moL/L時促HSC增殖作用達(dá)到高峰(P<0.0005)。說明AngII能夠促進(jìn)HSC增殖，并具有濃度依賴性。
　　 8、AngII促進(jìn)αl(I)、αl(IV)、αl(IV)Col mRNA的表達(dá)
　　 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的αl(I)、αl(IV)Col基因和GA

13、PDH基因進(jìn)行定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度AngII作用24h后，αl(I)Col mRNA分別為與正常對照組比較均有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.0005)。αl(IV)Col mRNA表達(dá)結(jié)果與αl(I)Col基因類似。
　　 9、Ang II促進(jìn)HSC分泌TGF-β1
　　 正常情況下，HSC細(xì)胞能夠分泌較低濃度的TGF-β1，加入10-8、10-7、10-6moL/LAng II刺激后，TGF-β1濃度明顯升高與對照組相比

14、差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0005)。
　　 10、Ang II促進(jìn)HSC表達(dá)p38 MAPK
　　 Western blot結(jié)果顯示p38絲裂原活化蛋白激酶在38 kDa處存在特異性蛋白條帶。對各條帶進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，10-8、10-7、10-6moL/L Ang II作用24h后，p38 MAPK蛋白的相對含量與正常對照組相比具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.0005)。
　　 11、p38 MAPK抑制劑S

15、B203580可以阻斷AngII引起的TGF-β1表達(dá)上調(diào).與正常對照組相比，10-6moL/L AngII作用24h后能夠明顯促進(jìn)HSC細(xì)胞分泌TGF—β1(P<0.0005)；但當(dāng)加入SB203580預(yù)先阻斷p38 MAPK活性后，AngII引起的HSC分泌TGF-β1濃度明顯下降(P<0.0005)。說明p38 MAPK是TGF-β1的上游信號分子。
　　 12、p38 MAPK抑制劑SB203580可以阻斷AngII引起

16、的HSC增殖
　　 與正常對照組相比，10-6moL/L AngII作用24h后能夠明顯促進(jìn)HSC增殖；但當(dāng)加入SB203580預(yù)先阻斷p38 MAPK通路后，AngII引起的促HSC增殖作用明顯下降(P<0.0005)。說明AngII的促HSC增殖作用是通過p38 MAPK通路介導(dǎo)的。
　　 13、p38 MAPK抑制劑SB203580可以阻斷AngII引起的HSCeαl(I)、αl(IV)型膠原mRNA表達(dá)增加.10

17、-6moL/L AngII作用24h后，αl(I)Col mRNA明顯高于正常對照組(P<0.0005)；加入SB203580預(yù)先抑制p38 MAPK活性后，αl(I)Col mRNA為明顯低于未加入SB203580組(P<0.0005)。αl(IV)Col mRNA表達(dá)結(jié)果與αl(I)Col基因類似。
　　 結(jié)論:
　　 1、灑精性肝纖維化時血漿及肝組織內(nèi)AngII增高，后者與肝纖維化水平呈正相關(guān)。
　　 2、

18、ACEI能抑制酒精性肝纖維化的形成，降低血清HA、LN水平，減少肝臟內(nèi)I、IV型膠原蛋白表達(dá)。證明AngII具有促進(jìn)酒精性肝纖維化發(fā)生的作用。
　　 3、AngII促進(jìn)原代培養(yǎng)的HSC活化。
　　 4、AngII促進(jìn)原代培養(yǎng)的HSC增殖。
　　 5、AngII上調(diào)原代培養(yǎng)HSC細(xì)胞αl(I)、αl(IV)Col mRNA的表達(dá)。
　　 6、AngII能夠促進(jìn)HSC細(xì)胞合成和分泌TGF-β1。