RNA干擾雞TVB受體對(duì)ALV-B感染的影響.pdf

1、禽白血病的防治措施主要從控制傳染源、切斷傳播途徑、治療感染雞群三個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行，限于我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的基本情況，其中傳染源的控制和感染雞群的治療很難起到顯著的效果，而切斷傳播途徑是一條非常具有潛力且行之有效的思路。目前為止鮮有RNA干擾應(yīng)用于病毒細(xì)胞受體的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究在查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料后，尚無(wú)發(fā)現(xiàn)雞TVB受體在細(xì)胞活動(dòng)中的良性功能，于是設(shè)計(jì)了特異性抑制TVB受體蛋白合成的siRNA，從而防止ALV-B感染的研究。
　　B亞群禽白血病病毒

2、（ALV-B）的囊膜蛋白Env與TVB受體結(jié)合引起細(xì)胞死亡信號(hào)通路激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究利用這一特點(diǎn)，采用RNA干擾技術(shù)（RNA interface，RNAi），特異地沉默轉(zhuǎn)錄TVB受體的mRNA，使細(xì)胞不再表達(dá)能夠介導(dǎo)ALV-B感染的TVB受體，阻斷病毒入侵宿主細(xì)胞的途徑，從而達(dá)到抗病毒傳染的目的。本研究針對(duì)在雞體內(nèi)能夠介導(dǎo)ALV-B感染細(xì)胞的TVBS1和TVBS3兩型受體，分別以編碼這兩種受體的mRNA為靶向基因設(shè)計(jì)合成了2

3、對(duì)短的雙鏈小RNA（siRNA），根據(jù)載體特點(diǎn)和RNA干擾特點(diǎn)將siRNA中加入酶切位點(diǎn)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，將其加工為 shRNA，然后連接到干擾載體pSilencer2.1-U6上，分別命名為TpS1-1、TpS1-2、TpS3-1、TpS3-2，并隨機(jī)合成一個(gè)陰性對(duì)照TpSC。按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃設(shè)置不同的分組，轉(zhuǎn)染入生長(zhǎng)狀態(tài)良好的DF-1細(xì)胞中，篩選10天后獲得能夠穩(wěn)定復(fù)制轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細(xì)胞系，用ALV-B對(duì)其攻毒，維持7天后運(yùn)用間接免疫熒光法（IFA

4、）觀察 ALV-B在細(xì)胞中的復(fù)制情況。本研究的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3個(gè)接種陽(yáng)性質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組和1質(zhì)粒陰性個(gè)對(duì)照組，雛雞一日齡時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和質(zhì)粒陰性對(duì)照組按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃接種質(zhì)粒，四日齡時(shí)再次接種鞏固；7日齡時(shí)全部按計(jì)劃接種ALV-B。七日齡接種后，每6天剖檢一次，共進(jìn)行5次，通過(guò)對(duì)體重、免疫器官重量、p27抗原及淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+的連續(xù)檢測(cè)與分析以探究動(dòng)物體內(nèi)RNA干擾ALV-B的復(fù)制作用。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見實(shí)驗(yàn)組1中代表ALV

5、-B的熒光數(shù)量相較于對(duì)照組有所減少，而實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3與對(duì)照組無(wú)明顯差別，初步驗(yàn)證TpS1-1和TpS3-1的質(zhì)粒組合抑制了TVB受體的合成，TpS1-1+TpS3-2組合、TpS1-1對(duì)于TVB受體合成的抑制效果不明顯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組1的雞群對(duì)于ALV-B有一定的抵抗力，從而間接證明TpS1-1和TpS3-1質(zhì)粒的共同作用對(duì)于TVB受體干擾效果良好，而實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3與對(duì)照組無(wú)明顯差異，說(shuō)明TpS1-1和TpS3-2質(zhì)粒共