用于肝癌早期診斷生物可降解型納米粒分子顯影對比劑的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌在我國癌癥病死率中排名第二位，及早發(fā)現(xiàn)根治切除是目前提高治愈率的主要手段。目前臨床常用的檢測肝癌的手段主要是甲胎蛋白(alpha fetalprotein，AFP)測定和各種影像學(xué)技術(shù)。由于早期病變內(nèi)多為不成熟的幼稚血管。因此基于成熟灌注血管基礎(chǔ)上的各種影像學(xué)對比劑增強技術(shù)無法檢測早期病變。基于早期病變特點，設(shè)計特異性的診斷方案，提高檢測水平是早期發(fā)現(xiàn)病變提高治療效果的有效途徑。因此利用肝癌早期細(xì)胞表達(dá)的特異性物質(zhì)作為靶點，設(shè)

2、計與靶點特異性結(jié)合的分子顯影對比劑，增強顯影效果，是提高影像學(xué)診斷水平的可行途徑。
　　 有效的分子顯影對比劑應(yīng)具備一下特點：一、增加診斷的敏感性與特異性；二、提高組織特異性；三、降低內(nèi)在的顯影假象；四、在診斷過程中獲取更多有效功能信息。因此本課題設(shè)計以生物可降解型材料作為載體，與具有良好顯影功能的釓結(jié)合，制備四種具有優(yōu)良顯影能力的分子顯影對比劑，提高核磁共振的靈敏度，提高肝癌特別是早期肝癌的診斷水平。其一是，釓噴酸葡胺固體脂質(zhì)

3、納米復(fù)合物(SLN/Gd-DTPA nanoeomplexes)分子顯影對比劑；其二是，聚乳酸-聚乙二醇/釓噴酸葡胺納米復(fù)合物（PLA-PEG/Gd-DTPA nanocomplexes）分子顯影對比劑：其三是，釓標(biāo)記聚乳酸-聚乙二醇納米粒(Gd labeled PLA-PEGnanoparticles)分子顯影對比劑；其四是，血管內(nèi)皮生長因子抗體(anti-VEGF)-釓標(biāo)記聚乳酸-聚乙二醇-聚賴氨酸納米粒(anti-VEGF-PLA

4、-PEG-PLL-Gd)主動靶向分子顯影對比劑。系統(tǒng)研究了四種生物可降解分子顯影對比劑的藥劑學(xué)特征和生物學(xué)特征，探討其作為分子顯影劑的應(yīng)用前景。課題主要研究方法與結(jié)果如下：
　　 一、Gd-DTPA固體脂質(zhì)納米復(fù)合物用于分子顯影的初步研究
　　 選用陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)作為固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)的電荷調(diào)節(jié)劑，采用溶劑乳化揮發(fā)法制備陽離子固體

5、脂質(zhì)納米粒，納米粒與釓噴酸葡胺注射液(Gd-DTPA)分子自組裝制備SLN/Gd-DTPA納米復(fù)合物；透射電鏡觀察納米粒形態(tài)；ZETASIZER3000粒度分析儀測定其粒徑、粒度分布和zeta電位?？疾霺LN/Gd-DTPA納米復(fù)合物的體外顯影效果及其在血漿中的穩(wěn)定性，驗證其作為分子顯影劑的應(yīng)用前景。結(jié)果顯示溶劑乳化揮發(fā)法制備的陽離子SLN呈球形或類球形，平均粒徑188.5士2.98nm，zeta電位+19.83士0.90mV，制得的S

6、LN/Gd-DTPA納米復(fù)合物平均粒徑為196.1士2.01nm，zeta電位為+17.12士0.61mV。納米復(fù)合物體外顯影表明，與游離Gd-DTPA比較，SLN/Gd-DTPA納米復(fù)合物具有較強顯影能力，其顯影強度與SLN/Gd-DTPA納米復(fù)合物的濃度呈線形關(guān)系(r=0.9770)。納米粒血漿穩(wěn)定性考察表明SLN/Gd-DTPA納米復(fù)合物在血漿中孵育2h仍具有良好穩(wěn)定性，實驗條件下血漿蛋白不能解析SLN/Gd-DTPA納米復(fù)合物。

7、利用陽離子固體脂質(zhì)納米粒和Gd-DTPA通過分子自組裝制備SLN/Gd-DTPA納米復(fù)合物分子顯影對比劑，制備工藝簡單，納米復(fù)合物藥劑學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，是一種極富應(yīng)用潛力的核磁共振(MRI)分子顯影對比劑。
　　 二、PLA-PEG/Gd-DTPA納米復(fù)合物用于分子顯影的初步研究
　　 為了獲得比SLN更便于進(jìn)行進(jìn)一步修飾的分子顯影對比劑，選用生物可降解的材料PLA-PEG為載體制備Gd-DTPA納米復(fù)合物。PLA-PEG末端

8、可設(shè)計成有化學(xué)活性的殘基，因而較SLN具有更好的可修飾性，為制備具有主動靶向性的分子顯影對比劑提供了可能。因此，本部分選用PLA-PEG為材料，采用改良溶劑擴散法制備PLA-PEG納米粒，與Gd-DTPA自組裝，制得粒徑為187.9士2.30nm，zeta電位為-12.36士3.58mV，多分散系數(shù)為0.108的納米復(fù)合物?？疾霵LA-PEG/Gd-DTPA納米復(fù)合物的血漿穩(wěn)定性、體外磁共振顯影和體內(nèi)磁共振顯影，結(jié)果顯示該納米復(fù)合物與人

9、血漿孵育2小時后仍保持良好的顯影能力。顯影加強能力與納米復(fù)合物的濃度呈正相關(guān)性(r=0.987)。與商品化對比劑Gd-DTPA相比，納米復(fù)合物分子顯影對比劑可以獲得更好的加強信號及更長的體內(nèi)顯影時間，所制備的納米復(fù)合物作為分子顯影劑具有較好的前景。
　　 三、釓標(biāo)記PLA-PEG納米粒用于分子顯影對比劑的研究
　　 使用化學(xué)合成的方法將Gd接合至材料上，制備的納米粒分子顯影對比劑與自組裝比較，應(yīng)具有更好的穩(wěn)定性和更好的顯

10、影特性。所以，本部分利用Gd與DTPA特異性結(jié)合反應(yīng)的特性，通過化學(xué)合成的方法將DTPA接合至生物可降解的PLA-PEG上獲得PLA-PEG-DTPA。用此新材料制備納米粒，表面有暴露的DTPA基團，可與GdCL3鰲合，由此制得釓標(biāo)記的PLA-PEG納米粒分子顯影對比劑。考查其理化性質(zhì)及細(xì)胞毒性、體外顯影與大鼠體內(nèi)顯影效果。結(jié)果顯示制得的Gd標(biāo)記納米粒平均粒徑為265.9士6.7nm，zeta點位為-18.71士2.3 mV，多分散系數(shù)

11、為0.104。Gd標(biāo)記納米粒分子顯影對比劑的細(xì)胞毒性與商品化對比劑Gd-DTPA相比沒有顯著差異。在3.0T磁共振儀檢測中，rl值為18.865mM-ls-l，r2值為24.863mM-1 s-1。在Gd劑量相同時，納米粒分子顯影對比劑體內(nèi)信號加強顯著大于Gd-DTPA，T1像保留時間為4.5小時，肝臟的靶向效率為14.57。因此，釓標(biāo)記的納米粒可作為肝被動靶向分子顯影對比劑。
　　 四、抗體-釓標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米粒

12、主動靶分子顯影對比劑的研究
　　 PLA-PEG-PLL比PLA-PEG-NH2具有更多易于修飾的多氨基官能團，有利于制備主動靶向分子顯影對比劑。本部分利用PLA-PEG-PLL材料的多氨基，使用合成的方法DTPA接合至材料上制得PLA-PEG-PLL(DTPA):與NHS-Biontin反應(yīng)制得PLA-PEG-PLL(Biotin):PLA-PEG-PLL分別與PLA-PEG-PLL(DTPA)和PLA-PEG-PLL(Bio

13、tin)混合通過溶劑擴散法制備納米粒，利用納米粒表面活性氨基經(jīng)戊二醛醛基化后將血管內(nèi)皮生長因子抗體(anti-VEGF)接合至納米粒表面得到抗體標(biāo)記納米粒，最后經(jīng)納米粒表面DTPA與GdCL3鰲合制備而得到anti-VEGF-釓標(biāo)記主動靶向納米粒分子顯影對比劑；利用多氨基活性基團進(jìn)行生物素化得PLA-PEG-PLL(biotin)，與PLA-PEG-PLL混合制得納米粒后利用生物素-親和素(biotin-avidin)特異反應(yīng)與avid

14、in-異硫氰酸熒光素(FITC)偶合，制備anti-VEGF-FITC標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米粒。制得的釓標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米粒、anti-VEGF-FITC標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米粒、anti-VEGF-釓標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米粒平均粒徑分別為69.8士5.3nm、82.5+5.8nm和85.8士7.2nm，zata電位分別為23.03士4.6mv、22.77d:2.5mv和21.63士2.4mv，血漿穩(wěn)

15、定性結(jié)果顯示anti-VEGF-釓標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米粒分子顯影對比劑與血漿孵育4小時未觀察到聚集現(xiàn)象，納米粒具有良好的血漿穩(wěn)定性。經(jīng)3.0T磁共振儀檢測，T1馳豫率R1值為18.394 mM-l s-1，T2馳豫率R2值為24.35mMq s-1。納米粒分子顯影對比劑體內(nèi)加強信號顯著大于Gd-DTPA，H22小鼠肝癌移植瘤TI像保留時間為4.5小時，H22小鼠肝癌模型中與Gd-DTPA注射液相比，anti-VEGF-釓標(biāo)記納

16、米粒腫瘤靶向效率為46.9:與釓標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米粒納米粒相比，腫瘤靶向效率為3.2。說明所制備的anti-VEGF-釓標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米?？商禺愖R別肝癌早期血管形成過程表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子，對肝癌腫瘤具有顯著的主動靶向顯影診斷效率，達(dá)到分子顯影對比劑所需的靶向強化要求，所制備的anti-VEGF-釓標(biāo)記PLA-PEG-PLL納米?？勺鳛榉肿语@影對比劑應(yīng)用于肝癌早期診斷，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
　　

17、綜上所述，SLN/Gd-DTPA納米粒復(fù)合物作為分子顯影對比劑具有較好的穩(wěn)定性和良好的體外顯影效果，并具有被動靶向肝臟的潛力。PLA-PEG/Gd-DTPA納米復(fù)合物其體外顯影能力優(yōu)于SLN/Gd-DTPA納米粒復(fù)合物，在大鼠體內(nèi)具有良好的肝臟靶向效率。釓標(biāo)記PLA-PEG納米粒顯著提高了對比劑的馳豫率，在減低濃度即可獲得良好的顯影效果，在大鼠體內(nèi)呈現(xiàn)良好的肝臟靶向效率優(yōu)于SLN/Gd-DTPA和PLA-PEG/Gd-DTPA納米復(fù)合物