TRAIL對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901-VCR耐藥基因表達(dá)的影響及TRAIL聯(lián)合順鉑殺傷SGC7901-VCR的研究.pdf

1、胃癌的發(fā)病率仍較高，胃癌的診治仍是腫瘤診治中面臨的挑戰(zhàn)之一。早期胃癌診治效果良好，十年生存率近90％，但國(guó)內(nèi)早期胃癌的檢出率仍較低。大部分患者診斷時(shí)已經(jīng)處于中晚期而不得不接受化療?；煻嗄陙砣允俏赴┲委煹囊粋€(gè)比較重要的方法。但胃癌化療中一個(gè)令人沮喪的問題是胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥問題，又稱為多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。因此，將胃癌耐藥現(xiàn)象作為研究方向，探索其可能的內(nèi)在機(jī)制和尋找對(duì)抗腫瘤細(xì)胞耐藥的干預(yù)物將

2、具有很大的價(jià)值，為篩選出抗耐藥或逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物打下基礎(chǔ)。
　　 我們?cè)谝郧暗膽?yīng)用免疫組化的方法的研究中觀察到在人的胃癌細(xì)胞中耐藥基因如LRP、GST-π高表達(dá)且與COX-2呈正相關(guān)。同樣ELISA法在體外培養(yǎng)的胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中，也觀察到上述基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)被抑制的現(xiàn)象。用COX-2抑制劑塞來昔布能下調(diào)這種表達(dá)，證實(shí)COX-2高表達(dá)與上述耐藥基因的活性的關(guān)系，顯示用外來物對(duì)耐藥基因的干預(yù)可能是有效的。腫瘤壞

3、死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducingligand，TRAIL)能誘導(dǎo)某些種類的腫瘤細(xì)胞凋亡，還對(duì)一些腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用。近來還發(fā)現(xiàn)TRAIL和一些抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)表現(xiàn)出協(xié)調(diào)效應(yīng)，使耐藥或部分耐藥的腫瘤細(xì)胞變得對(duì)藥物有敏感性了。TRAIL增加化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的效力的機(jī)制何在？是經(jīng)典的對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用、與抗腫瘤藥物的協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞作用還是通

4、過抑制了腫瘤細(xì)胞耐藥基因進(jìn)而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性而增強(qiáng)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。通過我們既往的研究結(jié)果，我們假設(shè)可能是后者即通過抑制腫瘤細(xì)胞耐藥基因而使腫瘤細(xì)胞的耐藥性發(fā)生逆轉(zhuǎn)。若果真如此，將對(duì)解決困擾胃惡性腫瘤化療的耐藥問題提供較好的切入點(diǎn)。因此，本課題分為兩個(gè)研究部分:第一部分我們采用不同濃度的TRAIL與胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR共同培養(yǎng)，觀察TRAIL對(duì)耐藥基因MDR1，LRP和GST-π有無作用效果，上調(diào)還是下調(diào)？目的是

5、對(duì)TRAIL在耐藥基因的調(diào)節(jié)中扮演的角色進(jìn)行探索;第二部分我們將TRAIL聯(lián)合化療藥物順鉑加入胃癌細(xì)胞株SGC-7901/VCRTRAIL中，探討亞毒性劑量的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)聯(lián)合小劑量化療藥物順鉑(DDP)能否協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901/VCR的活性、提高SGC-7901/VCR的凋亡率和干預(yù)其多藥耐藥基因1(MDR1)的表達(dá)，為進(jìn)一步走向臨床研究打下基礎(chǔ)。
　　 第一部分:TRAILI對(duì)胃癌耐藥細(xì)

6、胞株SGC7901/VCR中MDR1，LRP和GST-π耐藥基因表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 研究TRAIL對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901/VCR多藥耐藥基因MDR1，LRP和GST-π的表達(dá)的影響，為最終在臨床上使用TRAIL逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥，解決胃癌細(xì)胞多藥耐藥問題提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR與不同濃度的TRAIL(50，100，200，400 ug/L)培養(yǎng)

7、48 h，沒有任何干預(yù)措施的SGC7901/VCR細(xì)胞株作為對(duì)照，RT-PCR檢測(cè)各組胃癌耐藥細(xì)胞株耐藥基因MDR1，LRP，GST-π mRNA的表達(dá)。同時(shí)用ELISA法檢測(cè)各組胃癌耐藥細(xì)胞株中三種耐藥蛋白P-gp、LRP和GST-π的表達(dá)含量;用t檢驗(yàn)及單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，研究TRAIL對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞株多藥耐藥基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.RT-PCR結(jié)果:
　　 對(duì)照組中胃癌耐藥

8、細(xì)胞株SGC7901/VCR中的三個(gè)耐藥基因MDR1，LRP，GST-π均呈陽(yáng)性，mRNA值分別為0.88±0.01，0.91±0.04和1.01±0.13。胃癌耐藥細(xì)胞株被四種濃度的TRAIL作用，48 h后，胃癌耐藥細(xì)胞株中的MDR1，LRP，GST-πmRNA的表達(dá)被抑制，并隨著濃度的增高，抑制效益愈強(qiáng)，但未顯示出線性關(guān)系。TRAIL組的MDR1mRNA值在四個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)組均較對(duì)照組顯著降低（分別為0.78±0.02;0.69±0

9、.05;0.55±0.01和0.53±0.01，與對(duì)照組相比，四組均p＜0.05）。隨著TRAIL的濃度50μg/L、100μg/L、200μg/L遞增，MDR1mRNA被抑制幅度有逐漸遞增的趨勢(shì)，各個(gè)濃度組之間均顯示出顯著性差別(P＜0.05)。但當(dāng)濃度增加到400μg/L時(shí)，對(duì)MDR1mRNA的抑制程度與200μg/L時(shí)對(duì)比，無顯著性差異(p＞0.05)。同樣，TRAIL組的LRPmRNA值在50，100，200，400μg/L四個(gè)

10、濃度的實(shí)驗(yàn)組均較對(duì)照組顯著降低，其數(shù)值分別是0.85±0.05;0.76±0.05;0.59±0.04和0.58±0.02，全部四種濃度均較對(duì)照組顯著降低p＜0.05)。隨著TRAIL的濃度50μg/L、100μg/L、200μg/L遞增， LRPmRNA被抑制程度有逐漸遞增的趨勢(shì)，各個(gè)濃度組之間均顯示出顯著性差別(P＜0.05)。但當(dāng)濃度增加到400μg/L時(shí)，對(duì)LRP mRNA的抑制程度與200μg/L時(shí)對(duì)比，亦無顯著性差異(p＞0

11、.05)。與前兩者表現(xiàn)相似的是:TRAIL組的GST-πmRNA值在四個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)組均較對(duì)照組顯著降低（分別為0.89±0.04;0.77±0.08;0.65±0.06;0.61±0.03。與對(duì)照組相比，四種濃度均顯著降低，p＜0.05）。隨著TRAIL的濃度50μg/L、100μg/L、200μg/L遞增，GST-πmRNA被抑制程度有逐漸遞增的趨勢(shì)，各個(gè)濃度組之間均顯示出顯著性差別(P＜0.05)。但當(dāng)濃度增加到400μg/L時(shí)，對(duì)

12、GST-πmRNA的抑制幅度與200μg/L時(shí)對(duì)比，無顯著性差異(p＞0.05)。
　　 2.ELISA結(jié)果:
　　 P-gp，LRP，GST-π蛋白的表達(dá)在對(duì)照組中分別是49.04±2.07 ug/L、119.35±1.04 ug/L和58.62±1.38 ug/L;與對(duì)照組相比濃度為50 ug/L的TRAIL組P-gp，LRP和GST-π的含量分別為40.42±1.89 ug/L、112.51±1.19 ug/L和5

13、7.56±1.19 ug/L（與對(duì)照組相比均p＜0.05）。濃度為100 ug/L的TRAIL組P-gp，LRP和GST-π的含量分別為36.49±0.94 ug/L、106.69±1.51 ug/L和52.30±0.80 ug/L，也均較對(duì)照組顯著降低(p＜0.05)。同時(shí)濃度為100 ug/L的TRAIL組與50 ug/L TRAIL組相比也顯著降低（均p＜0.05）。濃度為200 ug/LTRAIL組P-gp，LRP，GST-π的

14、對(duì)應(yīng)數(shù)值為25.15±0.69 ug/L、83.54±2.15 ug/L和31.41±1.65 ug/L，比對(duì)照組顯著降低(p＜0.05)。與濃度為100 ug/L TRAIL組相比也顯著降低（均p＜0.05)。濃度400 ug/L TRAIL組P-gp，LRP，GST-π的水平相應(yīng)是24.45±1.41 ug/L、82.63±1.35 ug/L、30.80±1.34 ug/L，與對(duì)照組、50 ug/L TRAIL組、100 ug/L

15、TRAIL組比較，均顯著降低(p＜0.05;)。然而濃度400 ug/L TRAIL組與200 ug/L TRAIL組比較，P-gp，LRP和GST-π的降低并無顯著性差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.MDR1，LRP，GST-π在胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR均有表達(dá)。
　　 2.在四種濃度的TRAIL的干預(yù)下，SGC7901/VCR中耐藥基因MDR1、LRP和GST-π的表達(dá)均較對(duì)照組顯著

16、下降且下降幅度與濃度有關(guān)。
　　 3.TRAIL除了促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用，它還可能通過降低腫瘤耐藥細(xì)胞株中耐藥基因MDR1，LRP，GST-π在的表達(dá)而降低胃癌的耐藥，增強(qiáng)化療藥物的療效。
　　 論文第二部分:TRAIL聯(lián)合順鉑殺傷胃癌細(xì)胞株SGC-7901/VCR和對(duì)耐藥基因MDR1表達(dá)的干預(yù)研究
　　 目的:
　　 探討腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(TRAIL)和小劑量化療藥物順鉑(DDP)對(duì)胃癌細(xì)胞株

17、SGC-7901/VCR的活性和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)多藥耐藥基因1(MDR1)的影響。
　　 方法:
　　 運(yùn)用MTT法檢測(cè)不同濃度的TRAIL和順鉑對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR的活性或增殖的影響。篩選出TRAIL及順鉑的亞毒性劑量。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRAIL和順鉑的亞毒性劑量下單用及聯(lián)合應(yīng)用后的細(xì)胞凋亡率。TRAIL和順鉑聯(lián)合應(yīng)用后，用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胃癌耐藥細(xì)胞株耐藥基因MDR1 mRNA的表達(dá)。同時(shí)用ELIS

18、A法檢測(cè)耐藥蛋白P-gp的表達(dá)含量，研究TRAIL對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞株多藥耐藥基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法檢測(cè)藥物對(duì)SGC-7901/VCR細(xì)胞活力的影響的結(jié)果顯示:
　　 順鉑和TRAIL都可一定程度上殺傷胃癌耐藥細(xì)胞SGC-7901/VCR，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活力下降。經(jīng)計(jì)算48 h順鉑的IC10（活性抑制10％）為0.535g/L，以MTT結(jié)果選取200μg/L作為TRAIL濃度較合

19、適。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示對(duì)照組、順鉑組、TRAIL組、TRAIL順鉑聯(lián)合用藥組中，作用48 h后胃癌細(xì)胞凋亡率以聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果:
　　 對(duì)照組中胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR的耐藥基因MDR1呈陽(yáng)性。胃癌耐藥細(xì)胞株被TRAIL和順鉑聯(lián)合作用48小時(shí)后，胃癌耐藥細(xì)胞株中的MDR1 mRNA的表達(dá)被抑制，較對(duì)照組顯著降低(p＜0.05)。聯(lián)合用藥

20、組細(xì)胞凋亡明顯升高，與對(duì)照及單藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.ELISA法結(jié)果:
　　 與單藥組比較，聯(lián)合用藥組協(xié)同作用明顯，P-gp蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中耐藥基因MDR1高表達(dá)，MDR1是胃癌多藥耐藥的耐藥基因。
　　 2.TRAIL與順鉑聯(lián)合具有協(xié)同抑制胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901