Liraglutide神經(jīng)保護(hù)作用的行為學(xué)和在體電生理研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種慢性、原發(fā)性、不可逆性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)和記憶能力喪失，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆。AD的一個(gè)典型病理特征是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑，其主要成分是淀粉樣β蛋白(Amyloidβ-protein，Aβ)。目前，Aβ的神經(jīng)毒性作用已有廣泛報(bào)道，如引起培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡、腦組織突觸可塑性下降和空間學(xué)習(xí)記憶行為的傷害等。因此，AD病因的“

2、Aβ學(xué)說”已被廣泛認(rèn)可。然而，由于Aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的機(jī)制很復(fù)雜，迄今為止，其機(jī)制還不是很清楚且臨床上仍然缺乏有效對(duì)抗Aβ的藥物。因此，積極尋找能夠拮抗Aβ神經(jīng)毒性的藥物或治療手段對(duì)AD的預(yù)防和治療將具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 近年來一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是，AD與另外一種退行性疾病即Ⅱ型糖尿病(T2DM)在發(fā)病過程、病理變化、臨床表現(xiàn)和預(yù)后上有著驚人的相似。所以，有人把AD也稱為Ⅲ型糖尿病?；贏D與T2DM的相似性以及AD病因

3、的“Aβ學(xué)說”，近年來提出的一個(gè)治療AD的新策略就是：利用控制T2DM的于段干預(yù)AD，以減少Aβ的產(chǎn)生和聚集、拈抗Aβ的神經(jīng)毒性、增強(qiáng)Aβ的降解和清除。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種腸分泌的促胰島素分泌激素，由于其以葡萄糖依賴性方式促進(jìn)胰島素的分泌，從而最大限度的減少血糖過低的危險(xiǎn)，因而成為目前治療T2DM的最新藥物。GLP-1不儀可以刺激胰島β細(xì)胞增殖和再生、促進(jìn)胰島素分泌、抑制

4、胰高血糖素釋放，也可以作用于中樞增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶功能。有研究表明，包括海馬在內(nèi)的很多腦組織都有GLP-1及其受體(GLP-1R)的表達(dá)。還有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GLP-1降低腦內(nèi)Aβ水平；發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，保護(hù)神經(jīng)元免受谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；能夠有效阻止Aβ引起的海馬突觸可塑性即長時(shí)程增強(qiáng)(long term potentiation，LTP)的損傷。由于天然的GLP-1很不穩(wěn)定，在血液中的半衰期只有2-3分鐘，故本研究使用了GLP-1類似物

5、Liraglutide。目前Liraglutide已經(jīng)上市，可用來治療T2DM，其不僅半衰期較長，還具有較GLP-1更強(qiáng)的生物活性。然而，Liraglutide的神經(jīng)保護(hù)作用仍需要完整的在體和離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)。Liraglutide是否可以有效拮抗Aβ引起的認(rèn)知功能傷害，是否能夠保護(hù)在體海馬突觸傳遞可塑性，目前仍然不清楚，其神經(jīng)保護(hù)作用的行為學(xué)和電生理研究也少有報(bào)道。因此，本研究采用行為學(xué)觀察和電生理記錄手段系統(tǒng)探討了GLP-1的神經(jīng)保護(hù)作

6、用及其可能機(jī)制。研究主要分為以下兩部分：(1)采用Morris水迷宮技術(shù)觀察了海馬注射Liraglutide對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷的影響。(2)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用在體大鼠海馬CA1區(qū)場(chǎng)電位記錄方法，觀察了Liraglutide是否可以拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的晚期長時(shí)程增強(qiáng)(L-LTP)的損傷。
　　 第一部分：Liraglutide保護(hù)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶免受Aβ25-35引起的損傷
　　 為闡明

7、Liraglutide在腦內(nèi)的神經(jīng)保護(hù)作用，我們采用經(jīng)典Morris水迷宮行為學(xué)方法觀察了雙側(cè)海馬注射Liraglutide對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間、學(xué)習(xí)記憶功能傷害的神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)選用反應(yīng)靈活、無視力和運(yùn)動(dòng)障礙的成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，麻醉固定后在腦立體定位儀引導(dǎo)下，用微景注射泵將藥物緩慢注入雙側(cè)海馬，待動(dòng)物清醒并恢復(fù)兩周后，進(jìn)行Monrris水迷宮行為學(xué)測(cè)試。測(cè)試由三部分組成：定位航行實(shí)驗(yàn)、空間

8、探索實(shí)驗(yàn)和可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)。主要觀察各種藥物處理對(duì)大鼠逃避潛伏期、游泳距離、大鼠處于目標(biāo)象限（即平臺(tái)所在象限）所占的時(shí)間百分比和距離百分比，以及大鼠游泳速度的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)Aβ25-35能夠顯著降低大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力。雙側(cè)海馬注射4nmol Aβ25-35后，在定位航行實(shí)驗(yàn)（隱藏平臺(tái)測(cè)試）中，與對(duì)照組相比，從訓(xùn)練的第2到5天，大鼠尋找水下平臺(tái)的時(shí)間和游過的距離明顯延長(P＜0.01)，例如，在第5天時(shí)，Aβ25

9、-35組大鼠逃避潛伏期和找到平臺(tái)所游過的距離分別為17.62±1.22s和262.93±28.85cm，明顯長于對(duì)照組的12.30±0.20cm和150.69±14.02cm(P＜0.01)。在空間探索實(shí)驗(yàn)（第6天）中，Aβ25-35組的大鼠處于目標(biāo)象限的時(shí)間占游泳總時(shí)間的百分比和距離百分比分別為為24.85±0.89％和23.30±2.06％，明顯短于對(duì)照組的44.79±1.61％和43.10±2.08％(P＜0.01)。(2) Li

10、raglutide單獨(dú)給予與對(duì)照組大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。在定位航行實(shí)驗(yàn)中,5nmolLiraglutide對(duì)大鼠逃避潛伏期和找到平臺(tái)所游過的距離無明顯影響，與對(duì)照組相比，沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；在空間探索實(shí)驗(yàn)中,5 nmol Liraglutide組大鼠處于目標(biāo)象限的時(shí)間占游泳總時(shí)間的百分比和距離百分比分別為43.36±1.36％和44.93±0.79％，與對(duì)照組的44.79±1.61％和43.10±2.0

11、8％相比也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。(3) Liraglutide劑量依賴性地保護(hù)了Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力損傷。在定位航行實(shí)驗(yàn)中，低劑量組Liraglutide(0.05 noml)預(yù)處理的大鼠逃避潛伏期和找到平臺(tái)所游過的距離與單獨(dú)給予Aβ25-35組無明顯差異(P＞0.05)；隨著Liraglutide濃度增加兩者均減小，且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。在訓(xùn)練的第5天，0.5 nmol和5 nmol Li

12、raglutide+Aβ25-35組大鼠逃避潛伏期分別為14.50±0.36 s(P＜0.05)和13.32±0.31s(P＜0.05)；逃避距離分別為200.47±8.64cm（P＜0.05）和188.87±12.34cm(P＜0.05)，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，0.5nmol和5nmol Liraglutide預(yù)處理組的大鼠處于目標(biāo)象限的時(shí)間占游泳總時(shí)間的百分比分別為38.01±1.67％和43.22±0.93％，

13、距離百分比分別為37.76±1.56％和40.94±1.61％，明顯高于Aβ25-35單獨(dú)給予組(P＜0.01)，且隨著濃度的增加而逐漸增大，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。(4)可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)顯示，Liraglutide和Aβ25-35的單獨(dú)使用及聯(lián)合應(yīng)用均未影響大鼠的視力和運(yùn)動(dòng)能力。各組游泳速度沒有明顯差異(P＞0.05)，基本維持在18cm/s。逃避潛伏期也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，維持在14s左右。
　　 結(jié)論：雙側(cè)海馬注射

14、Aβ25-35嚴(yán)重?fù)p害了大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，而Liraglutide卻劑量依賴性的拮抗了Aβ25-35引起的學(xué)習(xí)記憶能力損傷。該結(jié)果提示，腦內(nèi)GLP-1的高表達(dá)或使用GLP-1類似物L(fēng)iraglutide有可能在AD等神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療中起到積極的作用。
　　 第二部分：Liraglutide保護(hù)大鼠在體海馬晚期長時(shí)程增強(qiáng)免受Aβ25-35引起的損傷
　　 本實(shí)驗(yàn)采用電生理手段記錄大鼠在體海馬場(chǎng)興奮性突觸后

15、電位(fieldexcitatory postsynaptic potential，fEPSP)，觀察了Aβ25-35和Liraglutide及二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)晚期長時(shí)程增強(qiáng)(L-LTP)的影響，旨在探討Liraglutide拮抗Aβ25-35神經(jīng)毒性作用的電生理學(xué)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用水迷宮實(shí)驗(yàn)后的SD大鼠，麻醉后固定于腦立體定位儀上，將自制的綁定電極（同心圓雙極刺激電極和單極記錄電極），精確插入到海馬的刺激及記錄部位。通過給予

16、海馬Schaffer側(cè)枝單個(gè)測(cè)試刺激、雙脈沖刺激及三組高頻刺激(high frequency stimulation，HFS)，在海馬CA1區(qū)放射層誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)fEPSP、配對(duì)脈沖引起的雙脈沖易化(paired pulsefacilitation，PPF)以及HFSs引起的L-LTP。觀察各種藥物對(duì)基礎(chǔ)fEPSP、PPF及L-LTP的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)海馬注射Aβ25-35顯著抑制了高頻刺激引起的海馬在體L-LTP

17、。海馬注射4nmol Aβ25-35后，fEPSP平均幅度在HFSs后1h、2h和3h時(shí)分別為133.75±6.46％(P＜0.01)，118.70±4.05％(P＜0.01)和113.50±3.19％(P＜0.01)，明顯低于對(duì)照組的162.28±4.94％，159.24±1.85％和153.41±2.79％，表現(xiàn)出明顯的L-LTP抑制效應(yīng)。而單獨(dú)給予Liraglutide沒有明顯影響L-LTP幅度(P＞0.05)。(2)聯(lián)合應(yīng)用不同

18、濃度Liraglutide劑量依賴性拮抗了Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬L-LTP損傷。給予HFSs后3h，不同濃度的Liraglutide(0.05，0.5和5 nmoI)+Aβ25-35組的fEPSP幅度分別為120.50±4.29％(P＞0.05)、140.84±4.81％(P＜0.05)和152.49±4.60％(P＜0.05)。其中，高濃度組(0.5和5 nmol)fEPSP幅度均明顯高于單獨(dú)給予Aβ25-35組的fEPSP幅度(P

19、＜0.05)，且隨著Liraglutide濃度的升高，Aβ25-35引起的L-LTP的壓抑效應(yīng)逐漸得到改善。(3)實(shí)驗(yàn)中各組的PPF沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示各種藥物影響L-LTP主要不是通過突觸前機(jī)制進(jìn)行的。
　　 結(jié)論：Liraglutide預(yù)處理可劑量依賴性保護(hù)Aβ25-35引起的在體大鼠海馬CA1區(qū)L-LTP的損傷作用。Liraglutide對(duì)海馬L-LTP的保護(hù)效應(yīng)與Liraglutide存行為學(xué)上的作用基本保持一致，

20、可能部分地從細(xì)胞機(jī)制方面解釋了GLP-1塒大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的改善。
　　 總之，本研究利用Morris水迷宮和電生理場(chǎng)電位技術(shù)，通過觀察大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及。記錄在體海馬L-LTP，探討了Liraglutide對(duì)抗Aβ25-35神經(jīng)毒性作用的效應(yīng)及可能電生理機(jī)制。結(jié)果顯示，Liraglutide能夠有效對(duì)抗Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和在體海馬L-LTP傷害，提示Liraglutide的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其對(duì)突