精氨酸加壓素對抗Aβ-,25-35-神經(jīng)毒性作用的行為學和電生理研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種慢性、原發(fā)性、不可逆性的神經(jīng)退行性疾病，以學習記憶等認知功能障礙、精神行為異常為主要臨床表現(xiàn)。AD典型的病理學特征包括腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑(細胞外)和神經(jīng)元纖維纏結(細胞內(nèi))。其中，老年斑中主要的神經(jīng)毒性成分是由39-43個氨基酸組成的β淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)。目前，有關Aβ及其有效片段如Aβ25-35、Aβ31-35的

2、神經(jīng)毒作用已有廣泛報道，故一般認為，AD的發(fā)病與Aβ在腦內(nèi)的沉積以及由此產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用有關。然而，Aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的細胞和分子機制很復雜，迄今為止還不十分清楚，也還缺乏有效的針對Aβ的抗AD藥物。
　　 精氨酸加壓素(Arginine vasopressin,AVP)作為神經(jīng)遞質(zhì)主要由視交叉上核、床紋終核、杏仁核和室旁核的神經(jīng)分泌小細胞所產(chǎn)生，是9個氨基酸構成的多肽。AVP的生理作用較廣泛，在外周血中以激素形式主要調(diào)節(jié)體

3、內(nèi)水電解質(zhì)平衡及調(diào)節(jié)血壓，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)可以影響和調(diào)節(jié)腦的高級功能如學習和記憶。有研究表明，AD患者腦內(nèi)和血漿內(nèi)AVP水平與正常人相比有明顯減少，這提示AD的發(fā)病可能與AVP在腦和血漿中的水平下降有關。此外AVP對老年人記憶的改善已有臨床報道，提示AVP可能具有對抗A神經(jīng)毒性的作用，在防治AD、改善記憶障礙方面可能發(fā)揮重要作用。然而，迄今為止關于AVP在神經(jīng)保護作用的行為學和電生理研究方面仍然存在分歧：此外，雖然有實

4、驗表明Aβ能夠損害大鼠學習和記憶功能，AVP可能與之相反，但AVP是否能夠逆轉(zhuǎn)或部分拮抗Aβ對認知功能的傷害至今仍未見報道。因此，本實驗的目的主要是利用行為學實驗手段進一步確定腦室內(nèi)注射AVP是否能影響大鼠的空間學習和記憶能力，特別是AVP的預處理是否能夠保護學習記憶功能免受Aβ的傷害。同時，我們還采用分子生物學和電生理手段檢測了海馬組織磷酸化Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(p-CaMKⅡ)的表達水平以及海馬神經(jīng)元的放電頻率，以探討

5、AVP發(fā)揮神經(jīng)保護效應的細胞和信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 本研究進行了如下三部分工作：(1)利用國際公認的經(jīng)典的Morris水迷宮測試手段，檢測了側腦室注射AVP對Aβ25-35損害大鼠空間學習和記憶能力的拮抗效應；(2)利用Western blot技術檢測了Aβ25-35和AVP對大鼠海馬組織p-CaMKⅡ表達水平的影響；(3)利用多通道細胞外記錄和鋒電位分類技術，觀察了側腦室注射Aβ25-35和AVP對大鼠在體海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自

6、發(fā)放電活動類型及頻率的影響，以及AVP對Aβ影響海馬神經(jīng)元自發(fā)放電活動的調(diào)制作用。由此，本研究從細胞、分子到行為學三個水平探討了AVP對抗Aβ神經(jīng)毒性作用的生物學效應及其機制，旨在為AD的發(fā)病機制以及AD的防治提供可能的新思路。
　　 第一部分、精氨酸加壓素阻止Aβ25-35引起的大鼠空間學習記憶傷害
　　 目的：本實驗通過使用Morris水迷宮方法探討AVP對抗Aβ所致大鼠空間學習、記憶功能傷害的神經(jīng)保護作用。

7、　　 方法：實驗取運動靈活、無視力障礙的成年雄性Wistar大鼠(230-250g)隨機分為對照組、Aβ25-35組、不同濃度AVP組、以及AVP和Aβ25-35聯(lián)合給予組，每組10只。行Morris水迷宮定位航行和空間探索實驗，分別測定大鼠空間定位學習和記憶能力。主要指標包括大鼠尋找平臺的平均逃避潛伏期和游過距離、撤除平臺后大鼠在目標象限游泳時間和游過距離占游泳總時間或總距離的百分比。同時，測定各組大鼠的游泳速度和視力，以除外運動和

8、視力障礙對測定指標的影響。
　　 結果：(1)對照組大鼠逃避潛伏期在訓練的第1、2、3、4、5天分別為73.7±6.5 s，55.4±10.1 s，28.9±7.5 s，11.2±2.3 s和9.5±1.2 s；大鼠找到平臺所游過距離分別為1799.9±242.6cm，1723.7±143.8 cm，677.5±176.4 cm，273.6±53.7 cm和223±29.3 cm；撤除平臺后動物在目標象限所花時間占游泳總時間的百

9、分比為49.3±0.3％；目標象限內(nèi)游過距離占總距離的百分比為49.6±0.2％。(2)腦室注射Aβ25-35(25 nmol)顯著降低了大鼠的空間學習和記憶能力，與對照組相比，平均逃避潛伏期和游泳距離兩個指標在各時間點均明顯延長(P＜0.01)；撤除平臺后動物在目標象限所花時間占游泳總時間的百分比減少至35.1±0.3％，游過距離占總距離的百分比也減少至35.1±0.2％，與對照組相比顯著縮短(P＜0.01)。(3)給予低劑量(0.1

10、 nmol/5ul)的AVP后，學習、記憶功能輕度提高，但與對照組比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；給予中等劑量(1 nmol/5ul)和高劑量(10 nmol/5ul)AVP后，大鼠定位航行與空間探索能力均明顯增強(P＜0.01)平均逃避潛伏期和找到平臺所游過的距離均明顯縮短(P＜0.01)。撤除平臺后，1 nmol組動物在目標象限所花時間占游泳總時間的百分比較對照組增加到57.9±0.03％，游過距離占總距離的百分比增加到58.1

11、±0.04％(P＜0.01)；10 nmol組動物分別增加為67.6±0.02％和67.1±0.04％(P＜0.01)。(4)聯(lián)合給予AVP和Aβ25-35后，不同劑量的AVP對Aβ25-35所致的定向航行和空間探索能力均顯示出一定的劑量依賴性保護效應。在0.1 nmol組，AVP對Aβ25-35的行為學傷害未顯示出明顯的改善(P＞0.05)；用1 nmol和10 nmol AVP處理后，平均逃避潛伏期和尋找平臺距離明顯小于單獨使用Aβ

12、25-35組(P＜0.05)，空間探索實驗則顯示：聯(lián)合給藥的1 nmol和10 nmol AVP組.在目標象限所花時間和游過距離占游泳總時間或距離的百分比較單獨使用Aβ25-35組明顯增加(P＜0.01)，1 nmol組分別為46.8±0.01％和47.1±0.02％；10 nmol組分別為52.2±0.02％和52.3±0.04％。(5)可視平臺測試結果顯示，與對照組相比，各處理組大鼠游泳速度和視力沒有明顯區(qū)別(P＞0.05)，表明大

13、鼠的運動功能和視力沒有受到所給藥物的影響。
　　 結論：腦室內(nèi)注射Aβ25-35能夠明顯傷害大鼠空間定位的學習和記憶功能；腦室內(nèi)單獨給予AVP(1 nmol和10 nmol)能夠在一定程度上提高大鼠學習和記憶能力，而AVP預處理能夠有效對抗Aβ25-35引起的大鼠空間學習記憶損傷，顯示出一定的劑量依賴性神經(jīng)保護效應。提示中樞AVP系統(tǒng)活動的上調(diào)可能對阿爾茨海默病的預防和治療具有積極的作用。
　　 第二部分、精氨酸加壓素和

14、Aβ25-35對大鼠海馬CaMKⅡ磷酸化水平的影響
　　 目的：本實驗使用Western blot技術檢測了慢性側腦室注射Aβ25-35和AVP對大鼠海馬神經(jīng)細胞質(zhì)膜上磷酸化Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(phosphorylated Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，p-CaMKⅡ)表達的影響，以揭示AVP在行為學上對抗Aβ的神經(jīng)保護效應機制。
　　 方法：行為學結

15、束后，四組大鼠(對照組、Aβ25-35組、AVP組、以及AVP和Aβ25-35聯(lián)合給予組)斷頭處死，取腦并分離出海馬，組織進行超聲勻漿、提取蛋白，然后采用Westernblot檢測海馬神經(jīng)元質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達。
　　 結果：(1)對照組大鼠海馬神經(jīng)細胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ表達量的平均灰度值為0.601±0.01(n=7)。(2)與對照組相比，給予10 nmolAVP后大鼠海馬神經(jīng)細胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達量增加，平均

16、灰度值為0.747±0.02，(n=7;P＜0.01)。(3)與對照組相比，給予Aβ25-35(25nmol/5ul)后大鼠海馬神經(jīng)細胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達量下降，平均灰度值為0.48±0.03(n=7;P＜0.01)。
　　 結論：腦室注射AVP能夠提高海馬神經(jīng)細胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達；腦室注射Aβ25-35能夠抑制海馬神經(jīng)細胞質(zhì)膜上p-CaMKⅡ的表達；AVP預處理能夠在一定程度上對抗Aβ25-35對海馬神經(jīng)細胞

17、質(zhì)膜上p-CaMKⅡ表達量的抑制作用。這提示Aβ和AVP對大鼠學習、記憶行為學的影響可能與海馬磷酸化CaMKⅡ的表達量有密切關系。
　　 第三部分、精氨酸加壓素保護大鼠在體海馬神經(jīng)元自發(fā)放電免受Aβ25-35的傷害
　　 目的：本實驗通過使用多電極細胞外記錄技術，觀察慢性側腦室內(nèi)注射AVP或Aβ25-35以及兩者聯(lián)合應用對大鼠在體海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，旨在為AVP對抗Aβ的神經(jīng)保護效應尋找電生理機制。

18、　　 方法：實驗采用雄性Wistar大鼠，麻醉后將其固定在腦立體定位儀上，將三根綁定的金鼠記錄電極精確插入一側海馬CA1。然后打開放大器，開始觀察并記錄各處理組大鼠的在體胞外自發(fā)性單單位放電的模式和放電頻率。記錄的數(shù)據(jù)通過利用Spike sorting技術和Matlab軟件進行分析。
　　 結論：Aβ25-35抑制了海馬神經(jīng)元的自發(fā)放電，而AVP能提高并且一定程度上對抗Aβ25-35對自發(fā)放電的傷害，提示大量單個細胞的放電和神