甲胎蛋白調(diào)控肝癌細胞(HepG2)增殖的作用機制研究.pdf

1、目的： 甲胎蛋白（AFP）是哺乳動物胎兒的一種主要胞漿蛋白。成人血清中高濃度的AFP與原發(fā)性肝癌和畸胎瘤有關(guān)。因而過去一直被認為是診斷原發(fā)性肝癌的特異性腫瘤標志物，具有早期診斷、鑒別診斷及確立診斷的作用。AFP在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的診斷價值是勿庸置疑的。然而，它不僅僅是單純作為一種伴隨出現(xiàn)的腫瘤特異性蛋白而存在。近年來，許多科學家經(jīng)過反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)甲胎蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中不是一種伴隨現(xiàn)象，而是一種與腫瘤細胞生長密切相關(guān)的內(nèi)源性

2、蛋白。雖然人們已發(fā)現(xiàn)血清中AFP水平的變化與非正常的生長表型相關(guān)，但它通常被認為是一種協(xié)同效應(yīng)，而不是導(dǎo)致表型改變的因素。至今為止，我們?nèi)圆荒芸隙ˋFP是否為出生缺陷與腫瘤發(fā)生中導(dǎo)致生長表型改變的直接因素。AFP在肝癌發(fā)生過程中的作用或者效應(yīng)尚不清楚。此研究的目的即分析AFP的相關(guān)功能，檢測其調(diào)控肝癌細胞增殖的能力，并探討其涉及的可能機制。 方法： 在本研究中，我們利用生物信息技術(shù)設(shè)計了一種以AFP為靶位的shRNA。在

3、化學合成shRNA的cDNA雙鏈后構(gòu)建入質(zhì)粒重組表達載體與重組腺病毒載體中，利用其進行體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達特異性AFPsiRNA。鑒于需要研究長期AFP基因的抑制效果，我們通過質(zhì)粒重組表達載體系統(tǒng)建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化AFPsiRNA的細胞系。我們應(yīng)用這些載體抑制AFP在HepG2細胞中的表達，通過Western blot與半定量RT-PCR分析確定了AFPsiRNA的高效性與特異性。為確定AFP靜默對于HepG2細胞生長的影響，我們應(yīng)用軟瓊脂克隆形成

4、實驗與生長曲線分析方法進行細胞表型研究。同時，我們應(yīng)用表達AFPsiRNA的重組腺病毒Adv-AFPsiRNA進行HepG2移植裸鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制實驗。而后，為探討導(dǎo)致HepG2細胞生長抑制的相關(guān)機制，我們應(yīng)用TUNEL檢測細胞凋亡并通過流式細胞儀分析細胞周期的改變。最后，我們?yōu)榇_定哪些相關(guān)基因受到AFP靜默影響參與這種細胞周期停滯效應(yīng)，利用cDNA芯片技術(shù)分析了AFP表達降低的HepG2細胞基因表達譜的變化并進行了半定量RT-PCR

5、驗證。 結(jié)果： 1．Western blot結(jié)果表明在pCDNA3．1/AFP+pENTR/U6/AFPsiRNA瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞48小時后，與空白對照（pCDNA3．1/AFP+pCDNA3．1）和陰性對照（pCDNA3．1/AFP+pENTR/U6/LacZsiRNA）相比，AFP的表達水平有了顯著的下降，蛋白表達抑制率達到90%。用重組Adv-AFPsiRNA感染HepG2細胞48小時后，通過western

6、 blot檢測，AFP的表達水平呈明顯而特異性的降低，蛋白表達的抑制率達75%。而與之相對應(yīng)的，Adv-LacZsiRNA對于AFP的表達水平則沒有明顯的影響。利用半定量RT-PCR方法驗證AFPsiRNA對于AFP在mRNA水平上的干擾作用。結(jié)果顯示，在內(nèi)參β-actin表達量相對一致的情況下，與陰性對照HepG2（-）相比，HepG2-B5細胞內(nèi)AFPmRNA水平明顯降低，抑制率達92%。 2．通過克隆形成實驗，我們證實感染

7、AFPsiRNA重組腺病毒的HepG2細胞克隆形成數(shù)與對照組比較降低了85%。在生長曲線分析中，pSilencer2．1-U6neo/AFPsiRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細胞（HepG2-B5）與對照組相比，生長速度呈明顯下降趨勢。在HepG2移植裸鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制實驗中，Adv-AFPsiRNA注射組的腫瘤生長與對照組相比受到明顯的抑制（p<0．001）。 3．TUNEL原位凋亡檢測結(jié)果顯示在Adv-AFPsiRNA感染細胞

8、中未呈現(xiàn)明顯的細胞凋亡，Adv-LacZsiRNA感染細胞和未處理細胞也沒有明顯細胞凋亡。與之相比，用已知可引起細胞凋亡的抗腫瘤藥物一鬼臼毒素（VM-26）（0．09mg/ml）處理48小時的HepG2細胞則多數(shù)呈現(xiàn)明顯的凋亡。而HepG2細胞（HepG2-B5）與對照組相比，生長速度呈明顯下降趨勢。在HepG2移植裸鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制實驗中獲得的腫瘤經(jīng)切片制備并HE染色，鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的組織學差異。用流式細胞儀進行細胞周期分析的結(jié)

9、果顯示在加入血清24小時后，處于G0/G1期的HepG2-B5和HepG2（-）細胞比例分別是7%（p=0．385）和64070（p=0．004）。這提示HepG2-B5細胞進入細胞增殖周期的比例下降。 4．應(yīng)用cDNA芯片技術(shù)并經(jīng)過半定量RT-PCR的驗證，我們篩選出一些基因表達水平發(fā)生顯著變化的細胞周期和細胞增殖相關(guān)基因，如cyclin D1、EBAG9、CDC34、SKP2、CSK等。 結(jié)論： 實驗結(jié)果表明