自我吞噬及mTOR信號在小鼠神經(jīng)瘤細胞分化過程中的作用.pdf

1、細胞分化是一種重要的生理現(xiàn)象。例如在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，正是細胞分化使得神經(jīng)干細胞衍生出了具有特定形態(tài)和功能的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞。而特定的蛋白合成對于進行分化和維持分化的狀態(tài)可能是必不可少的。因此，細胞分化可能需要在合成和降解代謝之間達到一個新的平衡。本工作旨在研究一個重要的細胞內(nèi)降解途徑(自我吞噬)和控制細胞合成代謝的一個關(guān)鍵激酶(mTOR)在神經(jīng)元樣分化中的潛在作用。 我們使用的模型是視黃酸誘導(dǎo)的小鼠成神經(jīng)細胞瘤(N2a細

2、胞)的神經(jīng)元樣分化。通過免疫熒光方法檢測神經(jīng)元特征性表達的蛋白——微管相關(guān)蛋白(MAP2)和神經(jīng)元特異性核抗原(NeuN)，觀察到誘導(dǎo)分化的N2a細胞有較強的MAP2和NeuN免疫反應(yīng)性，而未分化的細胞只有極弱的熒光強度。此外，誘導(dǎo)分化的細胞具有非常明顯的突觸樣神經(jīng)突起。所以這個模型在一定程度上可以用來模擬神經(jīng)元的分化過程。 1.自我吞噬對N2a細胞的神經(jīng)元樣分化必不可少為了了解自我吞噬這一重要的降解代謝途徑在細胞分化中的潛在作

3、用，我們分析了自我吞噬在細胞分化前后的水平。首先通過免疫印跡法，檢測LC3(哺乳動物中廣泛應(yīng)用的自我吞噬標記物)在細胞內(nèi)的蛋白表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化24小時后，LC3-Ⅱ的蛋白水平顯著升高。我們還觀察了GFP-LC3在轉(zhuǎn)染細胞中的表達模式，發(fā)現(xiàn)分化細胞中的GFP-LC3呈點狀分布，而未分化細胞則是均一分布。這些結(jié)果表明自我吞噬在細胞分化過程中被顯著激活。 自我吞噬在細胞分化中的上調(diào)提示其可能對細胞分化有重要作用。為了檢驗這

4、一假設(shè)，我們首先用小分子藥物來抑制自我吞噬，發(fā)現(xiàn)兩種抑制劑(3-MA和LY294002)強烈抑制了細胞分化。我們還采用了RNA干擾技術(shù)(RNAi)來降低Beclin 1(一種對自我吞噬必不可少的蛋白)的表達水平，從而下調(diào)自我吞噬。研究發(fā)現(xiàn)對beclin 1基因的RNAi降低了其蛋白表達水平，明顯延緩了細胞分化的進程。這些結(jié)果提示自我吞噬在N2a細胞的分化過程中是必需的。 2.mTOR在細胞分化中的重要作用mTOR是細胞生長的重要

5、調(diào)控蛋白，同時也負調(diào)節(jié)自我吞噬。為了揭示自我吞噬在分化過程中被激活的分子機制，我們檢測了mTOR信號通路中一系列蛋白的磷酸化水平，包括mTOR的底物S6K1和4E-BP1，以及上游的Akt和TSC2。研究發(fā)現(xiàn)細胞分化過程中mTOR信號通路顯著下調(diào)，并且在時間上對應(yīng)于自我吞噬的上調(diào)。這提示mTOR活性的降低可能導(dǎo)致了自我吞噬的激活?？紤]到mTOR對蛋白合成的重要調(diào)節(jié)作用，我們試圖通過雷帕霉素(rapamycin)充分抑制mTOR活性來觀察

6、其對細胞分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷帕霉素顯著抑制了細胞分化。在雷帕霉素的處理下，分化細胞的突起明顯變細變短；細胞胞體變?。簧窠?jīng)元特異性標記蛋白(MAP-2和NeuN)的免疫反應(yīng)性也均有下降。這些結(jié)果提示，mTOR活性對細胞分化過程中大分子合成與降解之間的平衡可能至關(guān)重要。一方面，下調(diào)的mTOR信號促進了自我吞噬，而自我吞噬對細胞分化是必需的；另一方面，適當?shù)膍TOR水平對于分化細胞內(nèi)的蛋白合成可能必不可少。 自我吞噬的分子機制和生理