TLR4、NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在病毒性心肌炎的表達(dá)及意義.pdf

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由嗜心性病毒感染心肌所致的心肌及其間質(zhì)的局灶性或彌漫性炎癥。是臨床和病理實踐中最常見的一類心肌炎。是臨床常見的心血管系統(tǒng)疾病之一，近年來在成人和青少年中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。鑒于心肌炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明了，迄今缺乏特效的治療方法：許多患者心肌病毒持續(xù)感染，免疫功能持續(xù)紊亂，病情遷延，常遺留頑固性心律失常、慢性心功能不全甚至進(jìn)展為擴(kuò)張性心肌病，治療上更為棘手。病毒性心肌

2、炎的臨床癥狀常不明顯，往往不能引起人們充分的重視，感染波及到心臟傳導(dǎo)組織時，可引起病人的突然死亡，其中兒童患病毒性心肌炎預(yù)后較差，尤其是嬰兒的病死率高達(dá)50％。因此，探索VMC的防治策略具有十分重要的理論價值和實踐意義。 Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是天然免疫針對病原微生物的一類感受器，在天然免疫中發(fā)揮著重要作用，并成為聯(lián)系適應(yīng)性免疫的紐帶。以往對TLR4的研究大多集中在TLR4對細(xì)菌感染的作用

3、。隨著研究的深入，近些年來TLR4在抗病毒免疫中的作用也日益受到關(guān)注?？滤_奇病毒(coxsackie virus，CV)是VMC最常見的病原體。眾多研究表明急性病毒感染可直接損害心肌細(xì)胞，是VMC發(fā)病的重要機(jī)制，因此本實驗研究TLR4、NF-κ B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在病毒性心肌炎中的表達(dá)及意義，希望通過以上研究為病毒性心肌炎發(fā)生發(fā)病機(jī)制提供某方面的參考，為臨床治療提供某些新的途徑，為心肌炎猝死的病理學(xué)診斷、死因分析提供簡便、實用、可行的監(jiān)測手

4、段和依據(jù)。 研究目的： 從病毒性心肌炎病毒被識別的機(jī)制入手，研究TLR4、NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其下游Caspase-3及Mstl在病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制的作用。運(yùn)用免疫組化技術(shù)及圖像分析技術(shù)觀察TLR4、NF-κB、Caspase-3及Mstl的表達(dá)分布情況及分析其相關(guān)性。并通過TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測心肌細(xì)胞凋亡的情況，并用RT-PCR技術(shù)檢測TLR4的表達(dá)。 材料和方法： 1.研究對象

5、 篩選并收集中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心2004年-2007年的尸體解剖案例中符合要求的30例心臟標(biāo)本作為實驗組。男17例，女13例，年齡在18-65歲。實驗組根據(jù)Dallas標(biāo)準(zhǔn)分為明確性心肌炎組(15例)和界限性心肌炎組(15例)。 收集廣州市殯儀館2007年由于交通事故死亡后立即解剖的15例正常心臟標(biāo)本作為對照組，其中男7例，女8例。 實驗組：明確性心肌炎 15例界限性心肌炎 15例對照組：正常心肌組 15例。

6、2.研究方法 2.1 形態(tài)學(xué)觀察：對所收集的標(biāo)本均進(jìn)行HE染色并采用免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemistry，IHC)檢測心肌組織中TLR4、NF-κ B、Caspase-3和Mstl的表達(dá)和分布。 2.2 TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測：對三組樣本進(jìn)行TUNEL細(xì)胞凋亡檢測，檢測心肌細(xì)胞凋亡的情況，并分析各組Caspase-3、Mst-1與凋亡指數(shù)(AI)的相關(guān)性。 2.3 RT-PCR技術(shù)：應(yīng)用

7、RT-PCR技術(shù)檢測三組樣本的TLR4受體的表達(dá)情況。 3.統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±s)表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義；組間變量采用相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.明確性心肌炎組的TLR4、NF-κ B、Caspase-3、Mst1顯著高于界限界限性組、正常心肌組(P<0.05)。 2

8、.界限性心肌炎組的TLR4、NF-κ B、Caspase-3、Mst1顯著高于正常心肌組(P<0.05)。 3.明確性心肌炎組TLR4的表達(dá)量與NF-κ B的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.624，P<0.05)，NF-κ B與Caspase-3的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.649，P<0.05)，Caspase-3與Mst1的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系((r=0.538，P<0.05)。界限性心肌炎組TLR4的表達(dá)量與NF-κ

9、 B的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.731，P<0.05)，NF-κ B與Caspase-3的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.576，P<0.05)，Caspase-3與Mst1的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系((r=0.617，P<0.05)。而正常心肌組織中TLR4的表達(dá)量與NF-κ B的表達(dá)量呈無相關(guān)關(guān)系(r=0.174，P>0.05)，NF-κ B與Caspase-3的表達(dá)量無相關(guān)關(guān)系(r=0.278，P>0.05)，Caspase-

10、3與Mst1的表達(dá)量無正相關(guān)關(guān)系((r=0.189，P>0.05)。 4.TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測結(jié)果：明確性心肌炎與界限性心肌炎組的凋亡指數(shù)均升高，兩者沒有統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)。與正常心肌組相比，明確性心肌炎組與界限性心肌炎組凋亡指數(shù)均升高，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。明確性心肌炎、界限性心肌炎中凋亡指數(shù)(AI)與Caspase-3的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，Mst1與Caspase-3的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而M

11、st1與AI無顯著相關(guān)關(guān)系。而正常心肌組凋亡指數(shù)(AI)與Caspase-3、Mst1與Caspase-3的表達(dá)、Mst1與AI均無顯著相關(guān)關(guān)系。 5.用RT-RCR技術(shù)檢測TLR4的表達(dá)，擴(kuò)增產(chǎn)物為239bp。 結(jié)論： 1.TLR4、NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在病毒性心肌炎疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。 2.Caspase-3、Mst1在引起病毒性心肌炎心肌細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。同時，Cas