番茄抗葉霉菌相關基因的鑒定及TRV 16K基因的功能分析.pdf

1、基因對基因抗性是植物抗病性的重要表現(xiàn)形式。番茄(Lycopersicon esculentum)與葉霉菌(Cladosporium fulvum)系統(tǒng)是研究基因對基因抗性的模式系統(tǒng)。番茄抗病基因Cf和互補的葉霉菌無毒基因Avr進行識別互作，激活下游信號傳導途徑，活化防衛(wèi)反應，導致番茄對葉霉菌抗性的產生，關鍵信號傳導基因的分離和功能分析將增進對番茄對葉霉菌抗性機理的理解。病毒誘導的基因沉默(Virus induced genesilenc

2、ing，VIGS)是近年發(fā)展起來的一種研究植物基因功能的強有力工具，已被廣泛應用于植物抗病性、生長發(fā)育及代謝調控相關基因的功能研究。由煙草脆裂病毒(Tobacco ratde virus，TRV)改造成的載體是目前利用最廣泛的VIGS載體。pTRV1中16K ORF在TRV介導的基因沉默中的作用尚不明確。 本論文研究內容包括兩部分。第一部分，從本實驗室已克隆的ACE(Avr/Cfelicited)基因片段，即Cf/Avr介導產生

3、過敏性反應時特異表達的cDNA-AFLP片段，中挑選6個具代表性的片段，采用VIGS技術鑒定這些片段對應基因在Cf-4/Avr介導產生過敏性反應中的作用，篩選獲取可能起重要作用的基因。第二部分，構建缺失16K ORF的pTRV1表達結構，將缺失型TRV與野生型TRV誘導基因沉默效果進行比較分析，明確pTRVl的16K ORF在基因沉默中的作用。所獲主要結果如下： 1、初步明確了6個ACE片段相應基因在Cf-4/Avr4介導產生過

4、敏性反應中的作用。根據(jù)對本實驗室已克隆的182個ACE片段進行的生物信息學基因功能預測結果，挑選其中6個，即ACE片段5、14、39、85、95和111，供基因沉默分析。ACE5和ACE95片段相應基因功能未知，ACE14、ACE39、ACE85、ACE111片段分別與鈣依賴蛋白磷酸酶(Calcineurin)、40S核糖體蛋白S13、含LRR蛋白激酶、HR指示蛋白HSR203J有顯著序列同源性。構建了插入這些片段供VIGS分析用的重組

5、質粒。進行了TRV介導的VIGS分析和Cf-4/Avr4介導的HR檢驗。結果表明，ACE14、ACE85、ACE111基因的沉默抑制植株生長，導致葉片畸形，因此這些基因可能與植株生長發(fā)育相關：ACE95基因的沉默顯著抑制Cf-4/Avr4介導的HR的產生，說NACE95相應基因可能在番茄抗葉霉病中起重要作用。 2、明確了pTRV1中16K ORF對TIV介導基因沉默的影響。利用Spe I和Stu I構建了缺失16K ORF的pT

6、RV1表達結構。比較分析了野生型TRv和缺失16K ORF的TRV載體介導的基因沉默效率。結果表明，在本氏煙中，缺失型TRv介導的基因沉默比野生型TRV更完全，基因完全沉默的植株百分率比野生型TRV增加了16％。在三生煙中，無論野生型還是缺失型TRV介導產生的基因沉默效率均很低，缺失型TRv介導產生的基因沉默效率相對更高。此外，轉化缺失型TRv結構的農桿菌接種后，植株接種葉和上部非接種葉中TRV的積累量均顯著低于野生型結構轉化菌接種植株