大黃素抑制TLR4介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是導(dǎo)致冠心病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。炎癥亦是動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊破裂誘發(fā)急性冠脈綜合癥事件的始動(dòng)環(huán)節(jié)，斑塊中炎性因子的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，炎性和抗炎因子的平衡失調(diào)是斑塊破裂的重要分子生物學(xué)機(jī)制。TLR4在AS斑塊形成、發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，深入研究TLR在AS發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制，可為

2、我們進(jìn)一步研究AS的發(fā)病機(jī)制，治療、預(yù)防AS等方面提供新思路。中藥抗動(dòng)脈粥樣硬化作用具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)，多種中藥已經(jīng)被用于防治動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病，并顯示出良好的作用。本實(shí)驗(yàn)主要探討TLR/MyD88/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑在AS斑塊中的作用，研究大黃素對(duì)AS斑塊的療效及分子機(jī)制。
　　 目的：
　　 在ApoE-/-小鼠上建立AS模型，綜合分析AS研究動(dòng)態(tài)和TLR細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，探討TLR/MyD8

3、8/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑在AS斑塊中的作用，研究大黃素抑制TLR4介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的作用及其分子機(jī)制。
　　 方法
　　 將60只雄性apoE-/-小鼠用普通顆粒飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組(n=15)和大黃素組(n=45)，再將大黃素組隨機(jī)分為高劑量組(1200mg/kg·d)、中劑量組(900mg/kg·d)和低劑量組（600mg/kg·d），每組均15只。正常對(duì)照組給予普通顆粒飼料，給模型組小鼠喂高

4、膽固醇飼料（0.25％膽固醇+15％脂肪），給大黃素組小鼠喂高膽固醇飼料+大黃素，12周后處死所有小鼠。進(jìn)行體重稱(chēng)量、血脂檢測(cè)、血清炎性因子檢測(cè)、病理檢測(cè)、免疫組化染色、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-RCR)及蛋白印跡等
　　 結(jié)果：
　　 1.體重的變化
　　 12周末各組小鼠體重均增加，模型組體重最高，顯著高于大黃素高劑量組(P＜0.05)。
　　 2.血脂水平
　　 各組TC濃度均

5、高于正常范圍。三個(gè)大黃素治療組TC水平均顯著降低(P＜0.05～0.01)，且大黃素高劑量組顯著低于大黃素低劑量組(P＜0.05)，藥物的作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)性。
　　 三個(gè)大黃素治療組LDL-C濃度較模型組均有所降低，且大黃素高劑量組和中劑量組均顯著低于模型組（P均＜0.05）。大黃素低劑量組與模型組間及三個(gè)大黃素治療組間均無(wú)顯著性差異（P均＞0.05）。
　　 3.血清炎性因子
　　 三個(gè)大黃素治療組的血清

6、hsCRP水平均顯著降低(P＜0.05～0.01)，且大黃素高劑量組顯著低于中劑量組和低劑量組（P均＜0.01）。
　　 各組Fib濃度比較，三個(gè)大黃素治療組均顯著低于模型組(P＜0.05～0.01)，且大黃素高劑量組顯著低于中劑量組和低劑量組（（P分別＜0.05和0.01）。
　　 4.斑塊組織病理學(xué)檢測(cè)
　　 大體病理見(jiàn)各大黃素干預(yù)組主動(dòng)脈表面AS病灶范圍均減少，且隨著大黃素劑量的增加，主動(dòng)脈表面AS病灶范圍

7、逐漸減少，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。
　　 5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)
　　 免疫組織化學(xué)染色顯示模型組和三個(gè)藥物干預(yù)組斑塊內(nèi)均有TLR4、TNFα、IL-6和MyD88的局部表達(dá)，但在大黃素各干預(yù)組的表達(dá)量均顯著減少，且隨大黃素劑量的增加，炎癥因子的表達(dá)顯著減少。
　　 經(jīng)特殊染色和免疫組化檢測(cè)斑塊結(jié)果顯示:大黃素干預(yù)能顯著增加斑塊內(nèi)膠原含量(P＜0.05～0.01，)，減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞的含量(P＜0.05～0.01)

8、，
　　 6.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)
　　 大黃素干預(yù)組TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)的水平比模型組均顯著降低(P＜0.05～0.01)，且大黃素高劑量組和大黃素中劑量組顯著低于大黃素低劑量組(P＜0.05)。
　　 7.Westernblot
　　 大黃素高、中劑量組的TLR4蛋白表達(dá)水平較模型組均明顯降低(P均＜0.05)，低劑量組有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　

9、 三個(gè)大黃素干預(yù)組TNF-α和IL-6的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05～0.01)，且高劑量組顯著低于大黃素中、低劑量組(P＜0.05)，而中、低劑量組間的蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠AS模型中，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)途徑與AS斑塊發(fā)生和發(fā)展之間具有密切相關(guān)性;
　　 2.大黃素阻斷TLR/MyD88/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路中相關(guān)