穿心蓮內酯抑制動脈粥樣硬化及其分子機制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atcheroscIerosis,AS)的病理改變是以動脈內膜下酯質沉積,伴隨平滑肌細胞增殖,纖維基質成分增加以及炎癥反應為特征,并通過各種生長因子和活性代謝產物的影響和調節(jié),刺激泡沫細胞形成,泡沫細胞的不斷產生和堆積導致酯質條紋,并進一步變成纖維帽,逐步形成粥樣硬化性斑塊。 核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-κB)最先是從B淋巴細胞中發(fā)現的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的kB序列特異性結

2、合的核蛋白因子,現已知kB序列存在于多種基因的啟動子和增強子中,NF-κB可與相關基因啟動子或增強子特殊kB序列相結合,調控多種基因的表達,在體內具有非常重要的生物學功能。 穿心蓮內酯(Andrographolide,Andro)是二萜類化合物,但是目前國內外對于Andro抗炎作用的分子機制仍然知之甚少。本實驗室先前的研究工作表明,Andro能夠共價修飾處于還原狀態(tài)的p50亞基上第62位半胱氨酸,因為該氨基酸位于NF-κB結合特

3、定DNA的關鍵部位,因此Andro的共價結合阻斷了NF-κB二聚體與靶基因特定DNA序列的結合,抑制炎癥介質的活化。那么,在動脈粥樣硬化形成過程中,穿心蓮內酯是否也通過抑制NF-κB信號通路的活化,具有抑制動脈粥樣硬化性狀的重要作用? 本研究旨在探索：(1)穿心蓮內酯對NF-κB信號通路的調控作用；(2)穿心蓮內酯對NF-κB信號通路的調控在動脈粥樣硬化中的作用：(3)初步篩選靶向抑制NF-κB的小分子化合物本研究分為體外實驗和

4、體內實驗兩部分： 一.體外實驗。探尋穿心蓮內酯對NF-κB信號通路的調控作用,主要包括： (一)采用E-selectin promoter-luciferase熒光素酶報告基因實驗探明Andro是否能夠抑制TNF-α引起的NF-κB活性。 (二)用Andro預處理人臍靜脈血管內皮細胞,再用酯多糖、佛波酯、TNF-α分別刺激細胞,然后通過流式細胞儀檢測Andro藥物干預是否可以下調活化的內皮細胞E-selectin

5、的表達。 (三)用Andro預處理小鼠的內皮細胞和巨噬細胞,再用酯多糖、佛波酯、腫瘤壞死因子分別刺激上述細胞,然后應用組織因子(TF)活性測定技術、蛋白免疫印記技術檢測Andro是否可以起到下調活化的內皮細胞和白細胞組織因子表達的作用。 (四)應用細胞轉染和TF promoter-luciferase熒光素酶報告基因實驗以探明Andro調控組織因子的表達是通過調控哪個靶位點實現的? 二.體內實驗。探索穿心蓮內酯對NF-κ

6、B信號通路的調控在動脈粥樣硬化中的作用,主要分解為下列實驗： (一)用apoE基因缺陷型(apoE-/-)小鼠以高酯飼料誘導構建動脈粥樣硬化動物模型。 (二)利用油紅O染色技術、H&E染色顯示主動脈竇和主動脈血管內膜酯肪斑塊的面積,血管壁的厚度,評價Andro治療在動脈粥樣硬化斑塊酯質沉積中的作用。 (三)全程監(jiān)測小鼠體重,評價Andro治療在物質代謝中的作用。 (四)分別于藥物治療前后,禁食12小時后取

7、血檢測血漿TG,TC,HDL-C,LDL-C水平,評價Andro治療對酯肪代謝的影響。 (五)應用電泳遷移率變動實驗(EMSA)分析Andro治療對NF-κB活性的影響。 (六)應用定量PCR技術分析Andro治療對NF-κB下游與炎癥,增殖及血栓相關靶基因E-selectin,VCAM-1,TF的mRNA轉錄的影響。 (七)利用免疫組化和免疫灰度統(tǒng)計技術,觀察穿心蓮內酯治療對E-selectin,VCAM-1,

8、TF,fibrin表達的影響。 本研究的實驗數據結果表明Andro具有下列作用和功能：(1)抑制NF-κB與E-selectin啟動子的結合,并且這種抑制作用具有時間依賴性和濃度依賴性；(2)抑制活化內皮細胞E-selectin的表達；(3)抑制活化內皮細胞和巨噬細胞組織因子(TF)的表達；(4)特異性地抑制組織因子啟動子NF-κB位點；(5)減輕動脈粥樣硬化斑塊的酯質損傷；(6)不影響動脈粥樣硬化小鼠的體重和血酯水平；(7)抑

9、制動脈粥樣硬化血管組織NF-κB的活性；(8)下調動脈粥樣硬化血管組織:E-selectin,VCAM-1,TF的mRNA水平；(9)下調E-selectin,VCAM-1,TF,fibrin的蛋白表達。 從以上實驗結果可以得出如下結論：本研究首次明確地證明了穿心蓮內酯通過阻斷NF-κB信號通路,抑制動脈粥樣硬化的進程；并證實了NF-κB信號通路在貫穿動脈粥樣硬化始終的炎癥中以及在斑塊的穩(wěn)定性和血栓形成方面具重要作用；進而證實了